通过恢复LCP1的泛素化作用，靶向LINC02613以抑制口腔鳞状细胞癌的转移和进展

《Cellular Signalling》：Targeting LINC02613 to inhibit oral squamous cell carcinoma metastasis and progression via the rehabilitation of LCP1 ubiquitination

胆固醇代谢紊乱通过激活p38 MAPK/JNK通路诱导tau异常磷酸化，该机制为阿尔茨海默病治疗提供新靶点。

　　

张梦琪|魏文石|祖恒冰

复旦大学附属华东医院神经科，上海200040，中国

摘要

胆固醇缺乏与阿尔茨海默病（AD）的发病机制有关，但其在tau蛋白磷酸化中的作用仍不清楚。我们研究了胆固醇生物合成中的关键酶24-脱氢胆固醇还原酶（DHCR24）的缺失是否通过p38 MAPK和JNK信号通路导致SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中tau蛋白过度磷酸化。利用编码DHCR24-cDNA或DHCR24-shRNA的慢病毒载体，我们建立了稳定的DHCR24过表达和DHCR24敲低SH-SY5Y细胞模型。Filipin III染色和UPLC-MS/MS结果显示，DHCR24敲低显著降低了细胞内的胆固醇水平，而过表达则提高了胆固醇水平。免疫印迹实验显示，在DHCR24缺乏的情况下，tau蛋白在Thr181、Ser199和Ser202/Thr205位的磷酸化程度选择性增加；总tau蛋白水平保持不变。同时，phospho-p38和phospho-JNK的水平上升了1.5至2.5倍，而总激酶水平没有变化，表明相关信号通路被激活。为了验证因果关系，我们将DHCR24沉默的细胞用不同剂量的p38抑制剂SB203580（0–40 μM）或JNK抑制剂SP600125（0–40 μM）进行处理。这两种化合物都能以剂量依赖的方式将tau蛋白的磷酸化水平恢复到基线水平，其中SB203580在40 μM时效果最佳，SP600125在20–40 μM时效果最佳。综上所述，这些数据表明DHCR24调控的胆固醇稳态通过p38/JNK信号通路影响tau蛋白的病理变化，为AD的治疗提供了新的靶点。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种常见的与年龄相关的神经退行性疾病，其病理特征是细胞外β-淀粉样蛋白（Aβ）的沉积和细胞内tau蛋白的过度磷酸化[1,2]。目前已有几种药物可用于AD的治疗，但这些药物只能缓解症状，无法治愈或延缓疾病进展，因此需要更深入的机制研究和新的治疗策略。AD患者的tau蛋白在Thr181、Ser199、Thr231、Ser262、Ser396和Ser422等位点发生过度磷酸化[3]。随着时间的推移，过度磷酸化的tau蛋白会聚集形成不溶性的神经纤维缠结（NFTs），破坏微管结构，影响轴突运输，最终导致神经元功能障碍和死亡[4]。因此，阐明tau蛋白过度磷酸化的机制对于开发有效的AD治疗方法至关重要。

越来越多的证据表明脑部胆固醇代谢紊乱与AD的发病机制有关[5, [6], [7]，但相关数据仍存在矛盾。一些荟萃分析显示血浆胆固醇水平与痴呆风险无关[8]，而另一些研究则发现胆固醇水平过低或过高都与风险增加相关[9,10]。这些差异可能反映了血脑屏障（BBB）对胆固醇进入中枢神经系统的限制。在脑内，胆固醇稳态通过神经细胞内的从头合成和调节来维持[11]。星形胶质细胞产生的胆固醇是神经元膜的重要组成部分，可调节信号传导和突触功能[12]。然而，脑部胆固醇是否以及如何影响tau蛋白的磷酸化仍是一个关键问题。

Greeve等人的神经病理学研究发现了一种新的神经保护基因——选择性阿尔茨海默病指标-1（Seladin-1），该基因在AD患者的海马体和内嗅皮质神经元中表达下调[13]。Waterham随后证实Seladin-1编码24-脱氢胆固醇还原酶（DHCR24），这是一种在胆固醇生物合成最后一步催化脱麦角甾醇还原为胆固醇的酶[14]。值得注意的是，衰老会导致脑内胆固醇水平下降[15]，而实验性降低脑内胆固醇水平会干扰大脑发育和功能[16]。这些发现将DHCR24视为胆固醇稳态与AD病理之间的潜在联系。

在本研究中，我们系统地研究了DHCR24敲低引起的细胞胆固醇缺乏对tau蛋白磷酸化的影响。我们的发现揭示了脑部胆固醇代谢紊乱与tau蛋白病理变化之间的机制联系，为AD的发病机制提供了新的见解，并为治疗提供了理论依据。

实验方法

细胞培养

人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系由中国科学院（上海）提供，具有完整的STR谱型和无支原体认证。细胞在含有10%胎牛血清（FBS，Gibco，美国）的Dulbecco改良 eagle培养基/F-12（DMEM/F-12，KeyGEN Biotech，中国）中培养，培养条件为37°C，培养箱内湿度为5% CO?。

慢病毒转染

慢病毒转染按照先前的方法进行[17]。

高效生成DHCR24缺乏和DHCR24过表达的SH-SY5Y细胞

为了研究DHCR24的功能作用，我们使用编码DHCR24-shRNA或DHCR24-cDNA的慢病毒载体分别建立了稳定的DHCR24敲低和DHCR24过表达SH-SY5Y细胞系。荧光显微镜观察显示，转染细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达强度较高，慢病毒转染效率约为90%（图1A）。RT-qPCR和Western blot分析表明，DHCR24的mRNA和蛋白质水平在DHCR24敲低组中降低了超过70%

讨论

本研究建立了DHCR24缺乏、细胞胆固醇耗竭与阿尔茨海默病（AD）相关位点（Thr181、Ser199、Ser202/Thr205）的tau蛋白过度磷酸化之间的新机制联系，这种联系通过p38 MAPK和JNK信号通路实现。通过结合生化、药理学和成像技术，我们发现DHCR24的沉默会导致膜胆固醇耗竭、脂质筏结构破坏，并通过p38 MAPK/JNK途径选择性提高tau蛋白的磷酸化水平。

作者贡献

M.Z. 进行实验、收集和分析数据，并撰写了初稿。W.W.和H.Z. 设计研究方案并监督整个研究过程。W.W.和H.Z. 审阅和编辑了手稿。所有作者都阅读并批准了最终版本的手稿。

作者贡献声明

张梦琪：撰写初稿、数据可视化、软件使用、方法设计、数据整理、概念构建。魏文石：撰写、审阅和编辑、研究监督、资金获取。祖恒冰：撰写、审阅和编辑、研究监督、资金获取。

资助

本研究得到了华东医院重点学科建设项目（资助编号：LCZX2207）和上海市金山区重点医学基金会（资助编号：JSZK2019A06）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。