为何不两者兼测？皮质醇与皮质酮在毒箭蛙应激生理研究中的双重评估

《Integrative Organismal Biology》：Why not both? A case study in measuring cortisol and corticosterone

本研究针对传统应激生理学中仅测量单一"主导"糖皮质激素(GC)的局限，通过对五种毒箭蛙的皮质醇(cortisol)和皮质酮(corticosterone)进行同步检测，发现毒箭蛙中皮质醇的丰度显著高于传统认知，且两种GC存在独立调控机制。研究通过ACTH挑战实验验证了水样激素检测法的可靠性，挑战了两栖动物以皮质酮为主导GC的固有认知，为理解GC的模块化调控及进化生态学意义提供了新视角。

　　

在动物生理学研究中，科学家们长期遵循一个基本原则：下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴在应对压力时主要产生一种糖皮质激素(GC)。大多数脊椎动物同时产生皮质醇(cortisol)和皮质酮(corticosterone)，但研究者通常只测量被认为是"主导"的那一种。这种简化做法基于一个假设——这两种GC在生理功能上是冗余的。然而，越来越多的证据表明，这种传统认知可能需要重新审视。

传统上，研究者通过ACTH挑战实验来确定哪种GC是"主导"的，即哪种GC对促肾上腺皮质激素(ACTH)的刺激产生显著反应。在没有条件进行ACTH挑战实验时，研究者则通常假设丰度更高的那种GC就是主导GC。这种将"主导性"与"丰度"混为一谈的做法，可能掩盖了重要的生理学真相。特别是在两栖动物研究中，皮质酮一直被普遍认为是主要甚至唯一的GC，这一认知主要基于20世纪70-80年代对少数蛙类和蟾蜍物种的体外研究。

然而，这种普遍认知正面临挑战。研究发现，这两种GC虽然共享生物合成途径的前体，但最终合成步骤并不重叠，两者不能直接相互转化。更重要的是，它们可能与糖皮质激素受体和盐皮质激素受体有不同的结合亲和力，在不同组织中可能发挥独特功能。例如，在人类中，虽然皮质醇被认为是HPA轴的主要效应激素，但皮质酮在中枢神经系统中发挥作用，并在产前应激反应中扮演重要角色。

针对这些科学问题，研究人员以毒箭蛙为模型开展了深入研究。选择这一研究系统具有多重考量：毒箭蛙是行为生态学和神经行为学研究的新兴模式生物，受到气候变化、栖息地破坏和壶菌病等多重威胁。由于体型较小(平均体长17-60毫米)且具有保护 status，传统的血浆多次采样不可行，迫切需要开发非侵入性研究方法。

研究团队采用了几个关键技术方法：首先建立了水样激素检测法，通过将青蛙个体放置在去离子水中1小时收集激素样本，使用C18固相萃取柱提取激素；采用ACTH挑战实验评估HPA轴反应性，使用0.5 μg/g体重的ACTH剂量进行腹腔注射；通过酶联免疫吸附测定(ELISA)同时检测皮质醇和皮质酮浓度；实验对象包括五种毒箭蛙：染色毒箭蛙(Dendrobates tinctorius)、黄金毒箭蛙(Phyllobates terribilis)、模仿毒箭蛙(Ranitomeya imitator)、齐氏毒箭蛙(Ranitomeya variabilis)和安东尼毒箭蛙(Epipedobates anthonyi)，所有样本来自伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的繁殖群体。

3.1 染色毒箭蛙中糖皮质激素的丰度与相关性

研究发现，在染色毒箭蛙中，皮质酮在血浆和水样中均比皮质醇更丰富，但这种差异相对较小。在水样中，皮质酮的释放率仅比皮质醇高11.4%。两种GC在水样中呈显著正相关，但在血浆样本中相关性不显著。水样中的皮质醇浓度与血浆中的皮质醇浓度呈正相关，而皮质酮的这种关系不显著。

3.2 ACTH挑战实验

ACTH挑战实验结果显示，注射ACTH后，皮质酮的释放率显著高于注射生理盐水的对照组，而皮质醇对两种注射均无显著反应。有趣的是，这种组间差异主要是由于生理盐水组皮质酮的显著降低所致，表明所有青蛙都对采样产生应激反应，但这种反应在对照组中会逐渐减弱，而在ACTH组中得以维持。

3.3 物种间糖皮质激素相对丰度的变异

对五种毒箭蛙的比较研究发现，四种物种的皮质醇释放率显著高于皮质酮，仅染色毒箭蛙显示皮质酮略高于皮质醇的趋势。特别值得注意的是，模仿毒箭蛙和齐氏毒箭蛙中皮质醇的释放率分别是皮质酮的6.2倍和12.7倍。与染色毒箭蛙不同，其他物种的两种GC之间没有显著相关性。

研究结论与讨论部分强调了多重重要意义。首先，研究结果挑战了"两栖动物中皮质酮始终更丰富"的普遍假设，证明毒箭蛙中皮质醇的丰度显著高于传统认知。其次，研究发现两种GC可能通过不同机制释放，皮质酮对ACTH挑战产生反应，而皮质醇可能在行为状态(如亲代照顾)中通过非ACTH途径上调，这种模块化调控为理解HPA轴功能提供了新框架。

研究还揭示了发育阶段可能影响GC谱系，染色毒箭蛙蝌蚪中皮质酮的丰度是皮质醇的7倍，而成蛙中两种GC的差异较小，提示GC功能可能随生命周期变化。从方法论角度，研究验证了水样激素检测在毒箭蛙中的应用价值，为小型濒危物种的生理学研究提供了非侵入性工具。

这项研究发表于《Integrative Organismal Biology》期刊，其科学意义超越了毒箭蛙研究本身，为脊椎动物应激生理学提供了重要启示：测量多种GC能更全面理解生理调节机制；"主导"GC的概念可能需要重新审视；非ACTH调节途径可能具有重要生理功能；不同GC可能对应激源类型、持续时间和行为状态有特异性反应。

研究展望部分提出了多个未来方向：需要更多物种的系统采样来确定GC丰度变异与系统发育、生活史的关联；需要探索不同应激源类型和时间尺度下GC的动态变化；需要研究GC受体和结合球蛋白的物种特异性差异；需要开发更精确的非侵入性检测方法。这些研究将有助于理解动物如何应对环境变化，为保护生物学提供生理学基础。