基于稀释法的固有pH值估算：在植物质外体样本中的概念验证

《ACS Omega》：Dilution-Based Estimation of Intrinsic pH: A Proof-of-Concept in Plant Apoplastic Samples

细胞外液pH测定新方法：基于稀释倍数与pH值线性关系的外推分析，无需化学试剂或复杂滴定，适用于微量样本。该法通过建立pH与稀释对数回归模型，利用截距估算未稀释样本pH值，并验证其与多点回归及两点回归结果的一致性。方法解决了传统直接测量受样本量限制的难题，同时提供缓冲容量指标，为植物生理学研究提供实用替代方案。

　　植物的胞间质pH值在理解叶片气体交换和营养运输过程中具有重要作用。然而，直接测量胞间质液的pH值常常受到样品体积小和实验技术限制的影响。本文提出了一种基于稀释的简便方法，用于估算胞间质液的原生pH值。该方法利用pH值与稀释因子对数之间的线性关系，通过外推该关系可以推断出未稀释状态下的pH值，而无需进行滴定或添加化学试剂。这种方法保留了样品的原生化学平衡，使得在微升级别提取物中能够实现稳健的pH值估算。此外，该方法还提供了一个经验性的缓冲能力指标，并可能为植物生理学研究中的胞间质pH评估提供一种实用的替代方案。

在植物生理过程中，胞间质作为连接大气与叶片之间气体交换的媒介，其酸碱特性对某些化合物的交换行为起着关键作用。例如，在氨的双向交换机制中，胞间质pH值起到了决定性的影响。在叶片中，交换模型中的补偿点电位是由铵离子与氢离子浓度的比例所决定的。因此，了解氢离子浓度或胞间质pH值是这些模型中不可或缺的输入参数。尽管已有多种方法可用于测定胞间质pH值，包括直接测量胞间质液，但这种方法面临的主要挑战是可用样品体积有限。从叶片组织中提取胞间质液通常是一个复杂的程序，仅能获得少量的样品，往往不足以进行直接pH测定。因此，样品必须进行稀释，但由于胞间质本身的缓冲能力，氢离子浓度并不随着稀释成比例地减少。要估算原始（未稀释）的pH值，需要了解样品的缓冲能力。这可以通过多种方法实现，如CO?滴定，但其应用通常涉及复杂的步骤。

尽管微电极可以在极小的体积中进行pH测定，但其在胞间质液分析中的应用受到限制。微电极结构脆弱、成本较高，且在低体积、弱缓冲的生物样品中容易出现信号不稳定和漂移的问题。校准过程也比标准电极更为复杂，且可重复性较差。相比之下，传统的pH测定方法在技术上更为简单、稳健，更适合常规分析。本文旨在介绍一种新的方法，用于估算小体积胞间质样品的原生pH值，该方法基于pH值与稀释因子之间的关系进行外推。

在实验过程中，叶样采集于2025年3月31日至5月9日之间，从冬季小麦作物中进行。每次采集时，大约收集三组5克的叶片材料，并将其冷冻保存直至处理。胞间质液的提取采用了一种经过改进的样品制备方法，该方法源自Husted和Schjoerring的描述。由于使用了冷冻样品，无法切割小叶片段（25毫米×50毫米），因此采用了较大体积的叶片片段进行提取。这种方法使得无需使用浸润液，且提取的样品中不含有任何添加的溶剂。

提取过程基于Mattsson和Schjoerring的技术，结合O’Leary等人描述的离心方法进行。在整个过程中未使用等张或缓冲溶液。离心操作在5分钟内以1000转/分钟和5摄氏度的条件下进行。离心后对叶片进行目视检查，确认大部分浸润液已被去除。由于提取过程较为繁琐，且从叶片组织中获得的胞间质液量有限，因此样品体积相对较小。

在分析前，样品使用一次性注射器过滤器（FilterBio，中国南通；PVDF-L，0.22微米）进行过滤。pH值的测定使用了InoLab pH 730p设备，结合Sentix 61玻璃电极进行。为了进一步分析，进行了线性相关和回归分析，使用了测得的pH值和稀释因子。根据实验结果，不同稀释倍数下的胞间质液被稀释了10倍、20倍、50倍或100倍。回归函数的形式为pH = a × log??(D)，其中斜率a = dpH/d log(D)可视为一个经验性的缓冲能力，与真实的缓冲能力呈反比关系。真实的缓冲能力定义为β = dn/dpH，其中n表示每升缓冲溶液中加入的等量强碱（或强酸）。回归线如图1所示，而pH测量结果如表1所示。对于少数样品，所有稀释水平的数据都可获得。即使只有三个自由度，我们也发现统计上显著的相关性，其显著性水平为p = 0.1–5%。未稀释样品的pH值（标记为1×）是从拟合曲线的y截距（b）推导出来的，代表了未稀释状态下的外推值。斜率的倒数与缓冲能力成正比。b值的范围从0.22到0.50，中位数为0.28 ± 0.073。

如图1所示，在某些情况下，回归分析仅基于两个数据点，这在统计上存在疑问。因此，我们评估了多点回归得到的截距（即估算的原始pH值）与仅使用同一样品的10倍和20倍稀释数据进行回归计算的结果之间的差异。这些结果如表2所示，展示了所提出方法的稳健性。估算的pH值差异大致与pH电极的随机误差相当。这表明，尽管多点回归的统计力量更强，但即使在无法进行更多稀释步骤的情况下，基于两个点的回归仍然能提供可靠的未稀释胞间质pH值估算。

本研究的一个局限性是样本量相对较小，这不可避免地降低了结果的统计强度。这一限制源于繁琐的提取过程以及胞间质液的有限供应。因此，当前的发现应被视为一个初步的证明概念，而非完整的统计分析。此外，本研究缺乏独立的验证，如在独立数据集中的重复或与其他模型的比较。这种缺乏验证降低了整体结论的可信度。虽然重复不在本次概念验证研究的范围内，但应在未来的实验中优先考虑。

该方法的另一个局限性是其尚未标准化，且在文献中不常见，这使得与其他研究的比较更加困难。此外，可能还存在一个潜在的问题，即在稀释过程中，离子强度的降低可能影响离解平衡，从而导致表观pKa值的偏移。然而，稀释过程中系统性地改变了溶液的理化性质，包括离子强度和相应的表观pKa值变化。尽管离子强度可能显著影响活度系数，从而影响表观pKa值，但这种影响是逐渐且与稀释成比例的。因此，pKa值的变化对稀释系列中测得的pH值趋势产生了持续的贡献。只要pH与log(D)之间的关系保持近似线性（如我们数据中所观察到的），回归分析就能捕捉到这些变化的累积效应。因此，未稀释样品的pH值估算不会受到pKa偏移的影响，因为这种偏移已被隐含地纳入到拟合函数中。这使得该方法即使在稀释过程中离子强度变化较大的情况下，也具有较高的稳健性。

本研究的方法提供了一种简单的方式，利用pH值与稀释之间的关系来估算胞间质液的pH值。该方法在相对较广的pH范围内表现出了良好的适用性。然而，本研究的范围仅限于冬季小麦作物，因此不能假设该方法具有更广泛的适用性。为了验证该方法的普遍有效性，必须在不同的植物种类和多样化的环境条件下进行测试。此外，为了验证该方法的普遍适用性，必须使用独立的数据集和在其他植物种类中进行实验。

此外，经验性的缓冲能力（即斜率b的倒数）可以与通过传统方法获得的缓冲能力值进行比较，例如CO?滴定（Oja等，1999）。为了验证线性关系，可以在未来实验中将未稀释样品包括在稀释系列的开始部分。这种方法的创新之处在于其简单性，特别是在传统方法难以应用的情况下，如样品体积极小的情况，这使得该方法成为现有技术的一种潜在补充。尽管该方法具有一定的局限性，但其在实际应用中的可行性使其在植物生理研究中具有重要的价值。