基于样本环法和计数珠法的流式细胞术中尺寸依赖性偏差的比较分析

《Analytical Chemistry》：Comparative Analysis of Sample Loop and Counting Bead–Based Methods for Size-Dependent Bias in Flow Cytometry

流式细胞术中系统比较了样品循环法与计数珠法的粒子浓度测量偏差，发现尺寸差异导致的水动力学行为不同是主要偏因，通过模拟证实布朗运动与流体阻力影响，提出基于尺寸差异的修正方程。

　　粒子数量浓度的准确测量在多个领域都具有重要意义，包括临床诊断、环境监测和工业应用。传统的测量方法通常依赖于流式细胞术，其中使用计数珠（counting beads）是一种常见的技术手段。然而，这种方法在面对目标粒子与计数珠尺寸差异较大的情况时，可能会引入与尺寸相关的偏差。为了解决这一问题，本研究系统地比较了传统计数珠法与基于样品环的测量方法，后者通过固定体积的样品进行总计数，从而减少尺寸依赖性偏差。实验结果显示，当目标粒子与计数珠尺寸相近时，两种方法的测量结果相似；但在存在显著尺寸差异的情况下，结果会出现明显偏差。进一步的模拟分析表明，较大尺寸的粒子受到更强的力，更容易被引导至检测区域，而较小的粒子则更多地受到布朗运动的影响，这会阻碍它们的整体运动。这些发现揭示了尺寸依赖性偏差的机制，确认了流体动力学行为差异对粒子分布和运动的影响。

基于上述研究，本研究提出了一个基于实验结果的经验方程，用于预测和缓解粒子浓度测量中的偏差。该方程可以与基于样品环的方法结合使用，以提高测量的准确性和可追溯性。这些成果对于开发更精确和可靠的粒子数量浓度测量方法具有重要意义，尤其是在生物医学和工业应用中，其中目标粒子与计数珠的尺寸可能存在较大差异。

粒子数量浓度的测量在许多实际应用中至关重要，如水质监测、细胞治疗产品的质量控制以及工业中的不溶性颗粒检测。在这些应用中，准确的浓度数据不仅有助于评估样品的纯度和一致性，还能支持更精细的分析和决策过程。然而，当前大多数用于粒子浓度测量的仪器，尤其是基于流系统的设备，通常难以准确确定通过检测区域的样品体积。这种体积测量的不确定性常常导致浓度计算的偏差，因此需要采用更精确的测量策略来确保结果的可靠性。

在计量学研究领域，多个研究团队已经在这方面取得了显著进展。一些团队开发了基于光学粒子计数器的方法，结合重复测量和基于注射器的重量减少技术，以估计稳态样品体积。他们还扩展了这些方法，用于亚微米颗粒的测量，并识别了相关不确定度来源。此外，另一些团队利用改进的粒子计数器，如光阻和流式成像系统，以减少偶发事件和光学效应带来的误差。还有一些团队开发了基于阻抗的参考方法，用于血液细胞计数，并探索了校准注射器和气体缓冲注射系统，以提高体积测量的精度。我们的团队则设计了一种基于定义的毛细管和商业流式细胞仪的样品环方法，该方法通过测量样品体积来实现更精确的浓度计算，并已在生物分子如DNA和RNA以及微珠的测量中进行了验证。

流式细胞术在粒子计数和浓度测量方面具有独特的优势，因为它可以处理包括细胞、细菌、细胞外囊泡和纳米颗粒在内的多种分析物。虽然流式细胞术常用于基于信号强度的定性分析，但其在浓度测量方面的潜力仍未被充分开发。目前，一种广泛应用的方法是使用计数珠，该方法假设计数珠和目标粒子具有相似的流体动力学行为，从而通过比例计算来确定目标粒子的浓度。然而，这种方法存在一定的局限性，例如成本较高，且假定计数珠与目标粒子在采样和检测过程中具有相同的流体动力学特性。此外，计数珠与目标粒子在尺寸或形状上的差异可能导致测量偏差，而这些偏差往往被忽视。因此，有必要对这两种方法进行系统比较，以揭示潜在的偏差来源并提高测量的准确性。

在本研究中，我们旨在识别和量化粒子数量浓度测量中可能存在的尺寸依赖性偏差，并探索其潜在来源。为此，我们系统地比较了传统计数珠法与基于样品环的方法，后者通过固定体积的样品进行总计数，从而减少尺寸依赖性偏差。实验结果显示，当目标粒子的尺寸与计数珠相近时，两种方法的测量结果相似；但在存在显著尺寸差异的情况下，结果会出现明显偏差。为了量化这些偏差，我们引入了一个新的参数——计数珠/样品环（CB/SL）比值，该比值可以用于不同实验条件下的比较。实验结果表明，该比值在不同尺寸的粒子之间呈现出显著的差异，从而验证了尺寸依赖性偏差的存在。

为了进一步探究这些偏差的来源，我们进行了多种实验和模拟分析。首先，我们考虑了样品环方法中可能存在的偏差来源，包括死体积的存在和不完全的总计数。死体积可能由额外的连接部件引起，导致样品体积的高估，从而影响浓度计算。此外，如果在死体积中出现涡旋，较小的粒子可能比较大的粒子停留更久，进而导致浓度测量的偏差。然而，实验结果显示，这种影响在我们的设置中非常有限，因为大多数事件在前几分钟内就被采集完毕。其次，我们评估了不完全总计数的可能性，但根据时间直方图数据，这种可能性也被排除。

在计数珠方法中，可能的偏差来源包括沉降效应。由于计数珠和目标粒子混合在样品管中，而样品管底部的样品线用于抽取混合物，因此沉降可能会影响不同尺寸的粒子被抽取至样品线的速率，从而引入偏差。我们通过延长采集时间来测试沉降效应的影响，结果表明，即使在长时间采集下，粒子比例仍然保持稳定，这说明沉降效应在我们的实验条件下并不显著。因此，尺寸依赖性偏差更可能发生在粒子从样品管进入样品线的过程中。

通过力平衡分析，我们进一步探讨了粒子运动的差异。模拟结果显示，较大尺寸的粒子受到更大的力，这些力主要来自于浮力与重力的差值，促使它们更快地向下移动，进入检测区域。相反，较小尺寸的粒子受到的力较小，因此更容易受到布朗运动的干扰，阻碍其整体运动。这些力的差异在微尺度上产生了细微的位移，而这种微小的位移在流体速度场的急剧变化下被放大，从而导致尺寸依赖性偏差。通过分析不同尺寸粒子所受力的相对贡献，我们确认了这些力在粒子运动中的关键作用。

此外，我们还通过扫描电子显微镜（SEM）测量和经验分析来进一步验证尺寸依赖性偏差的存在。SEM测量结果显示，所使用的计数珠和目标粒子的实际尺寸略大于其标称值，这表明尺寸的精确测量对于预测偏差至关重要。通过将CB/SL比值与实际尺寸进行比较，我们发现该比值呈现出线性趋势，从而支持了我们提出的经验方程。这一方程能够较为准确地预测尺寸依赖性偏差，为实际应用提供了理论依据。

最后，我们总结了本研究的主要发现。计数珠法虽然在实际应用中较为简便，但在目标粒子与计数珠尺寸差异较大的情况下，可能引入显著的偏差。相比之下，基于样品环的方法通过固定体积的样品进行总计数，能够有效减少这种偏差。力平衡分析进一步揭示了尺寸差异如何影响粒子的运动和分布，从而导致测量偏差。通过引入经验方程，我们能够预测并缓解这种偏差，为开发更精确和可追溯的粒子数量浓度测量方法提供了新的思路。

这些研究成果不仅有助于提高流式细胞术在粒子浓度测量中的准确性，还对其他涉及微粒分析的领域具有重要参考价值。例如，在临床实验室中，血液细胞计数是常规操作，而在细胞治疗产品的质量控制中，准确的浓度测量对于确保产品的一致性和安全性至关重要。在环境监测中，颗粒物的浓度分析对于评估空气质量和水体污染具有重要意义。而在工业应用中，不溶性颗粒的检测和计数对于过程控制和产品质量评估也极为关键。

因此，本研究的成果对于推动更精确和可靠的粒子数量浓度测量方法具有广泛的应用前景。通过系统比较和模拟分析，我们不仅揭示了尺寸依赖性偏差的机制，还提出了有效的解决方案，如基于样品环的方法和经验方程。这些方法和工具可以为相关领域的研究人员和工程师提供重要的参考，帮助他们优化测量流程，减少误差，并提高数据的准确性和可追溯性。此外，这些发现也为未来的研究提供了方向，例如探索更先进的测量技术、优化样品处理流程，以及开发更精确的模型来预测和校正测量偏差。总之，本研究为粒子数量浓度测量的标准化和精确化提供了新的视角和方法，有助于提升相关领域的研究和应用水平。