SIMPLIFY协议：一种适用于暴露组学、代谢组学、脂质组学和蛋白质组学研究的单相提取系统

《Analytical Chemistry》：The SIMPLIFY Protocol: A Monophasic Extraction System Suitable for Exposomics, Metabolomics, Lipidomics, and Proteomics Research

单相统一提取法SIMPLIFY在表观组学、代谢组学和脂质组学中的应用及优化研究。该方法通过优化甲醇-甲苯乙醚-异丙醇（20:15:15）溶剂体系，实现内源性代谢物和外源性化学品的同步高效提取，在质谱分析中展现出与现有方法（如ExMet、Folch）相当的提取效率（R2>0.78）和重复性（RSD<30%），特别适用于高throughput临床样本分析。

　　这项研究提出了一种全新的单次提取流程，名为SIMPLIFY，旨在提高代谢组学、暴露组学和脂质组学的分析效率。SIMPLIFY是一种统一的单相提取方法，能够在一次操作中同时提取外源性化合物和内源性分子，从而减少了实验步骤的复杂性和资源消耗。在临床研究中，尤其是需要处理大量样本的研究项目，这种简化流程具有显著的优势。与传统的多步提取方法相比，SIMPLIFY不仅能够提高实验效率，还降低了实验成本，同时保持了较高的分析准确性和可重复性。

SIMPLIFY的核心理念在于结合多种提取方法的优点，同时克服其局限性。传统上，代谢组学和脂质组学研究通常需要不同的提取方法来分别处理极性化合物和非极性化合物。例如，对于极性代谢物，通常采用甲醇（MeOH）或乙腈（ACN）进行蛋白沉淀；而对于脂质分析，常用Folch、Bligh和Dyer等方法。然而，这些方法通常需要多个提取步骤，不仅耗时，还可能引入额外的样本污染和分析偏差。SIMPLIFY通过使用一种包含甲醇、甲基叔丁基醚（MTBE）和异丙醇（IPA）的混合溶剂，实现了对极性、半极性和非极性化合物的统一提取，从而简化了整个实验流程。

为了验证SIMPLIFY的性能，研究者将其与实验室内部的现有方法进行了比较，包括针对代谢组学的ACN提取方法（ExMet）和针对脂质组学的改良Folch方法（LIP）。结果显示，SIMPLIFY在提取效率和重复性方面与这些传统方法相当，甚至在某些方面表现更优。例如，在代谢物分析中，SIMPLIFY能够检测到超过800种化合物，涵盖了从极性化合物（如氨基酸）到非极性化合物（如胆汁酸和胆固醇酯）的广泛范围。此外，SIMPLIFY还显示出良好的适用于衍生化分析和蛋白质组学研究的潜力，这使得该方法在多种研究场景中都具有应用价值。

在实验设计中，研究者对溶剂与样本的比例进行了优化，以确保提取的全面性和可重复性。通过使用不同的溶剂体积（如120、240、360和480微升），他们发现480微升的溶剂比例在大多数情况下表现最佳，能够有效提取多种化合物并保持较低的相对标准偏差（RSD）。这一比例在不同的样本类型（如血浆、粪便和细胞培养物）中均表现出良好的适用性。同时，研究者还使用了多种内标物（ISTD）来确保定量分析的准确性，这些内标物涵盖了不同化学性质的化合物，包括极性化合物、半极性化合物和非极性化合物。

在数据分析方面，研究者采用了基于液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）的技术，并结合了多种数据处理方法，如噪声水平定义、提取离子色谱图构建、特征积分、同位素峰分组、过滤、对齐和填补数据缺口。这些步骤确保了数据的高质量和可靠性。此外，研究者还对定量数据的线性关系进行了评估，结果表明SIMPLIFY在多种标准物质（如NIST SRM 1950和SRM 1957）的检测中表现良好，其相关系数（R2）大多超过0.95，说明该方法在定量分析方面具有较高的准确性。

为了进一步验证SIMPLIFY的跨实验室适用性，研究者在另一家实验室使用不同的仪器平台进行了独立评估。结果显示，SIMPLIFY在代谢物和脂质的检测中与传统方法表现出高度一致性，尤其在提取极性和半极性脂质方面具有优势。此外，SIMPLIFY还能够有效提取某些特定的环境污染物（如全氟烷基物质，PFAS），这在暴露组学研究中具有重要意义。尽管该方法在提取甘油三酯（TG）方面仍存在一定局限，但大多数TG仍能被有效检测，且其重复性满足研究需求。

除了代谢物和脂质的提取，SIMPLIFY还被评估用于衍生化化合物的分析，如短链脂肪酸（SCFAs）和三羧酸循环（TCA cycle）相关的代谢物。研究者使用3-硝基苯肼（3-NPH）对提取物进行衍生化处理，并通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）进行分析。结果表明，SIMPLIFY能够有效提取并分析这些衍生化化合物，且其重复性较好。此外，该方法还被用于蛋白质组学分析，研究者对A375黑色素瘤细胞进行了提取和分析，结果显示SIMPLIFY在提取蛋白质方面表现良好，尤其是在较低细胞数量的情况下，其蛋白注释的数量与传统的尿素裂解方法相当。

SIMPLIFY的主要优势在于其操作流程的简化和高效性。相比传统方法需要多个提取步骤和复杂的样品处理，SIMPLIFY仅需一次提取即可完成对多种化合物的分析，这不仅节省了时间和资源，还减少了实验过程中可能引入的误差。此外，SIMPLIFY的单相特性使其非常适合自动化处理，从而在大规模临床研究中发挥重要作用。其操作流程的简洁性也使得该方法更容易在不同的实验室之间进行标准化，有助于提高研究的可重复性和数据的一致性。

尽管SIMPLIFY在多种样本类型中表现出良好的性能，但其在提取某些特定化合物（如甘油三酯）方面仍存在一定的局限性。这可能是由于这些化合物的极性和溶解性特性与提取溶剂的匹配度较低所致。因此，未来的研究可以进一步优化提取溶剂的组成，以提高对这些化合物的提取效率。此外，研究者还指出，SIMPLIFY的内标物选择主要偏向于胆汁酸，这可能影响其在其他化学类别中的标准化能力。因此，未来可以考虑扩展内标物的种类，以提高方法的普适性和适用性。

总体而言，SIMPLIFY为代谢组学、暴露组学和脂质组学研究提供了一种高效、简洁且可扩展的提取方法。其能够同时处理多种化合物，适用于不同类型的生物样本，并且在定量分析和重复性方面表现出色。此外，该方法的单相特性使其非常适合自动化处理，从而在大规模临床研究中具有重要的应用前景。未来，随着对提取方法的进一步优化和内标物的选择拓展，SIMPLIFY有望成为更广泛使用的标准提取方法，为生物医学研究提供更加高效和可靠的支持。