一种模块化的T7 RNA聚合酶工具箱，将选择性miRNA检测与信号放大和蛋白质表达相结合

《Journal of the American Chemical Society》：A Modular T7 RNA Polymerase Toolbox Linking Selective miRNA Detection to Signal Amplification and Protein Expression

基因转录调控 | miRNA检测 | T7-Locks系统 | C12转录终止子 | 信号放大 | 细胞外转录翻译系统 | 分子计算 | 合成生物学工具箱 | 非泄漏设计 | 程序化生物传感

　　在生命科学领域，细胞通过复杂的生物化学反应网络（CRNs）来处理和整合多样化的分子信号。这些网络不仅实现了对信号的感知，还能够进行计算并产生相应的反应。然而，目前的合成类CRNs在并行处理和选择性响应方面仍存在不足，常常面临模块性差、兼容性问题或信号泄漏等挑战。为了克服这些问题，我们开发了一种多功能且无泄漏的T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）工具箱，该工具箱能够将特定的寡核苷酸检测转化为受控的转录和最终的蛋白质表达。这一系统的核心在于设计一种名为T7-Locks的模块化结构，该结构能够通过特定的寡核苷酸结合释放出活跃的T7启动子，从而触发转录过程。通过引入这种结构，我们实现了对微小RNA（miRNA）的高灵敏度检测，其开关比（ON/OFF ratios）超过了100。此外，我们还展示了如何通过C12间隔子实现转录终止，从而在模板中构建正反馈机制，实现信号的可控放大。最后，我们通过在细胞外的TX-TL系统中整合T7-Locks技术，成功实现了miRNA触发的蛋白质合成，这为合成生物学中的信息处理提供了一个通用策略。

在生物学系统中，CRNs的复杂性使得细胞能够高效地执行多路复用的分子计算任务。然而，在体外应用中，例如用于生物传感、分子计算或构建类似生命系统的结构，通常更倾向于使用简洁的策略，以减少能量消耗和组件数量。DNA和RNA因其高度的可编程性，成为构建合成CRNs的理想基础。现有的基于SDR（链置换反应）的系统、PEN（聚合酶-外切酶-切口酶）工具箱或ATP驱动的电路，都利用了DNA和RNA之间可预测的相互作用来实现分子传感、逻辑计算和受控的基因表达。然而，这些系统在将低信息输入转化为高信息输出时，仍面临一些限制，尤其是在需要将miRNA信号转化为任意RNA输出或蛋白质表达时，通常需要复杂的多步骤过程，这可能导致信号泄漏或检测阈值较高。为了解决这些问题，我们提出了一种新的方法，通过T7-Locks技术实现对miRNA的高选择性检测，并通过正反馈机制增强信号强度。

T7 RNAP是一种高效的酶，能够从特定的DNA模板上合成RNA，其识别和结合的区域是T7启动子序列。传统的T7启动子设计通常要求完整的启动子序列与DNA模板互补，这限制了miRNA作为直接触发信号的可能性。因此，我们设计了T7-Locks，其结构能够将T7启动子序列包裹在一个发夹结构中，只有当特定的miRNA或DNA触发信号与之结合时，才会释放出启动子，从而启动转录。这一设计不仅提高了系统的灵敏度和选择性，还确保了在没有触发信号时，系统能够保持高度的“关闭”状态，从而有效防止信号泄漏。通过将T7-Lock与荧光读数结合，我们实现了对miRNA的定量和定性检测，其开关比达到了令人满意的水平。此外，我们还通过C12间隔子实现了转录终止，这一设计使得我们能够在模板中构建正反馈机制，从而增强信号的放大效果。

为了进一步验证这一系统的有效性，我们设计了四个不同的T7-Locks，每个都针对不同的miRNA序列（miRNA-21、miRNA-29a、miRNA-141和miRNA-155）。这些T7-Locks的结构允许不同的寡核苷酸触发信号，同时保持高特异性。在没有触发信号的情况下，系统不会产生任何转录产物，这表明了其高度的“关闭”状态。在有特定miRNA触发信号时，系统能够释放出启动子并启动转录，产生相应的RNA输出。通过荧光读数，我们能够实时监测转录过程的效率和产物的生成情况。结果表明，不同T7-Lock与miRNA配对的转录效率存在差异，这可能与miRNA本身的二级结构有关。例如，miRNA-21、miRNA-29a和miRNA-141的T7-Locks具有较高的开关比，分别达到61、114和79，而miRNA-155的T7-Lock开关比略低，仅为5。这一结果说明，尽管T7-Locks系统在选择性方面表现优异，但在某些情况下仍需进一步优化以达到更高的灵敏度和特异性。

为了实现信号的放大，我们引入了一种基于正反馈的机制。通过在模板中插入C12间隔子，我们能够在转录过程中精确控制产物的长度，从而生成与输入信号相同的RNA序列。这些RNA产物可以作为新的触发信号，进一步打开更多的T7-Locks，实现转录的自我催化和信号的放大。这一策略显著提高了系统的灵敏度和响应速度。实验结果表明，当使用包含C12间隔子的放大模板时，miRNA-141触发的转录产物增加了约2.1倍，并且反应时间缩短了一半。这一发现证明了C12间隔子在实现信号放大和精确终止方面的重要作用。

除了实现RNA的检测和放大，我们还进一步拓展了这一工具箱的功能，使其能够用于蛋白质的合成。传统的miRNA功能主要体现在对mRNA的降解或抑制翻译，而我们则通过在DNA模板上设计T7-Locks，实现了miRNA触发的mRNA转录，并通过细胞外的TX-TL系统进一步将mRNA转化为蛋白质。这一过程的关键在于生成带有单链DNA悬臂的DNA模板，以便在转录过程中与T7启动子结合。我们开发了一种简便的PCR策略，利用C3或C12间隔子生成带有特定悬臂的DNA模板。通过将这些悬臂与T7启动子结合，我们实现了对mRNA的受控转录，并进一步将其转化为蛋白质。实验结果表明，使用C3间隔子的DNA模板在翻译过程中表现出最强的荧光信号，而C12间隔子的模板则显示出稍弱的信号，但仍然有效。这一结果表明，C12间隔子在转录终止方面具有通用价值，可以用于其他涉及聚合酶的系统中。

在细胞外的TX-TL系统中，我们成功实现了miRNA触发的蛋白质合成。这一过程不仅验证了T7-Locks技术在复杂环境中的适用性，还展示了其在合成生物学中的潜力。通过将miRNA-141触发的转录和翻译系统分别置于不同的环境中，我们能够观察到两种反应路径在时间上的差异。miRNA-141触发的RNA转录在不到1.5小时内完成，而蛋白质翻译则需要至少6小时才能完成。这一时间差反映了mRNA从转录到翻译的过程，以及蛋白质的折叠和功能化所需的时间。通过荧光读数，我们能够定量比较两种反应路径的信号强度，结果显示miRNA-141触发的蛋白质翻译具有较高的开关比（11），而RNA转录的开关比则达到了86。这些结果不仅证明了T7-Locks系统在信号处理方面的高效性，还展示了其在合成生物学中的广泛应用前景。

综上所述，我们开发了一种多功能且无泄漏的T7 RNAP工具箱，该工具箱能够实现从寡核苷酸检测到蛋白质表达的程序化信号传递。通过T7-Locks的设计，我们实现了对miRNA和DNA输入的高选择性响应，同时保持了系统的模块性和灵活性。此外，我们通过引入C12间隔子实现了转录终止和正反馈机制，从而增强了信号的放大能力。最后，我们通过PCR策略生成了带有单链DNA悬臂的DNA模板，使得miRNA触发的mRNA转录和蛋白质翻译成为可能。这一系统不仅在体外环境中表现出色，还为未来的体内应用提供了坚实的基础。随着合成生物学的发展，这一工具箱有望在生物传感、治疗电路和复杂生物系统的设计中发挥重要作用。