内质网应激强度与抗肿瘤免疫反应之间的负相关关系：基于钌(II)的光敏剂在头颈部鳞状细胞癌光动力治疗中的应用

《Journal of Medicinal Chemistry》：Inverse Correlation between Endoplasmic Reticulum Stress Intensity and Antitumor Immune Response with Ruthenium(II)-Based Photosensitizers for the Photodynamic Therapy of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

光动力疗法（PDT）通过ruthenium(II)光敏剂诱导头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞死亡，但其免疫原性机制尚不明确。本研究发现，Ru1和Ru2均具有微摩尔级光毒性，但诱导的细胞死亡途径不同：Ru1通过凋亡和ER应激触发免疫原性细胞死亡（ICD），而Ru2通过自噬和铁依赖性细胞死亡（ferroptosis）实现ICD，且后者在体内实验中显著增强抗肿瘤免疫应答。该研究挑战了传统观点，揭示PDT诱导的细胞死亡需结合具体机制优化临床应用。

　　光动力疗法（PDT）作为一种有前景的治疗策略，正在被广泛研究用于治疗头颈鳞状细胞癌（HNSCC）。然而，肿瘤细胞死亡所引发的免疫反应机制仍然不够明确。本研究通过比较两种基于钌（Ru）的光敏剂（PSs）在HNSCC模型中的效果，发现它们均表现出显著的光毒性，能够引发多种细胞死亡途径（包括自噬和铁死亡），并促进免疫原性细胞死亡（ICD）的标志性危险信号。令人惊讶的是，仅有一种光敏剂能够诱导凋亡和强烈的内质网（ER）应激，但却在体内引发了免疫耐受现象；而另一种光敏剂虽然没有引发凋亡，但其较温和的应激反应反而促成了更好的抗肿瘤免疫反应。这些发现挑战了以往认为PDT诱导的凋亡和ER应激是ICD必要条件的观点。我们的研究强调了PDT引发的细胞死亡平衡及其免疫信号的复杂性，并指出需要重新定义ICD诱导的标准，以合理设计下一代光敏剂。

头颈鳞状细胞癌是全球第六常见的癌症，每年约有90万例新发病例，且是第七大致命癌症，2022年导致超过45万人死亡。这类癌症源于头颈部黏膜上皮，包括口腔、鼻咽、口咽、喉部和声带等部位。烟草烟雾致癌物和酒精摄入是HNSCC的两个主要风险因素，它们的致癌作用往往相互增强。此外，人类乳头瘤病毒（HPV）感染也是HNSCC的一个风险因素，近年来与HPV相关的口咽癌发病率显著上升。大多数患者在肿瘤发展到局部晚期阶段才被诊断，这导致了治疗时机的延迟，进而影响预后。尤其是HPV阴性癌症患者的五年总体生存率低于50%。目前，铂类联合放疗是治疗局部晚期HNSCC的一线标准方案，但该治疗方式会产生急性及晚期毒性，如黏膜炎、口干、吞咽困难、血液学和肾脏毒性以及放疗诱导的纤维化。此外，约40–50%的局部晚期HNSCC患者会在接受这一治疗后复发。尽管近年来在HNSCC的治疗方面取得了进展，包括抗表皮生长因子受体（EGFR）靶向治疗和免疫检查点阻断免疫疗法（ICI），但这些治疗手段的疗效仍然有限。例如，仅有不到20%的患者对ICI表现出客观的肿瘤反应。因此，开发新的治疗策略对于改善患者预后和生活质量至关重要。

PDT作为一种替代或辅助治疗手段，具有微创、时空可控等优势，被用于多种病理状态的治疗，包括癌症。PDT的原理涉及三个非毒性因素：光敏剂、光和氧气。光敏剂是一种对光敏感的分子，能够优先在癌细胞中积累，其细胞毒性在特定波长的光照下被激活。光照使得光敏剂从基态单线态跃迁至激发态单线态，随后可能进一步跃迁至三线态。在该状态下，光敏剂能够通过类型I（电子转移）或类型II（能量转移）机制产生活性氧（ROS），包括超氧自由基（O??•）和羟基自由基（•OH）等，或产生高度氧化的单线态氧（1O?）。ROS会氧化细胞成分，如蛋白质、膜脂质或DNA，从而导致癌细胞死亡。目前唯一被批准用于治疗晚期HNSCC患者的光敏剂是Foscan，但其仅用于姑息治疗。尽管如此，大量临床研究已表明PDT在HNSCC治疗中的潜力。

PDT的机制与其作用于HNSCC的分子特征密切相关。HPV阴性HNSCC中，TP53基因突变率高达80%以上，TP53作为肿瘤抑制因子，与抗癌治疗的临床反应密切相关。虽然曾提出TP53状态可能影响PDT介导的细胞死亡，但已有研究表明一些Ru基化合物能够独立于TP53信号通路诱导ER应激。ER应激的诱导是通过未折叠或氧化的蛋白质在ER腔内的积累，从而导致ER折叠能力与蛋白质需求之间的失衡。这种失衡由ER膜上的三种传感器检测并启动未折叠蛋白反应（UPR）信号通路，包括PERK、IRE1α和ATF6。PERK和IRE1α的激活源于其寡聚化和自磷酸化，PERK的激活会磷酸化eIF2α，从而全局抑制蛋白质合成，但同时也会促进某些特定mRNA的翻译，如编码ATF4的mRNA。IRE1α的激活则会导致XBP1 mRNA的可变剪接，生成具有活性的XBP1s转录因子。ATF6的激活则使其从ER转运至高尔基体并进一步裂解，生成ATF6p50转录因子。最终，ATF4、XBP1s和ATF6p50会进入细胞核，调控与蛋白质稳态相关的基因表达，包括蛋白质折叠和降解。然而，如果蛋白质稳态无法恢复，当ER折叠能力被过量的错误折叠蛋白或长时间的ER应激所超越时，UPR会诱导细胞死亡程序，导致细胞被清除。一些预临床研究表明，Ru基化合物能够独立于TP53信号通路诱导ER应激，这对于HNSCC的治疗具有重要意义。

PDT的另一个显著特点是能够诱导一种能够激发适应性免疫反应的细胞死亡形式，即免疫原性细胞死亡（ICD）。经历ICD的癌细胞会在其表面或释放多种危险信号，统称为损伤相关分子模式（DAMPs）。其中，最广泛研究的DAMPs包括细胞膜上钙网蛋白（CRT）的转运、细胞外释放的高迁移率族蛋白1（HMGB1）和三磷酸腺苷（ATP），以及I型干扰素（IFN）的诱导。这些DAMPs被模式识别受体（PRRs）识别，并通过释放细胞因子和趋化因子，形成促炎环境，从而激活先天免疫系统，招募、激活和成熟抗原呈递细胞（APCs），如巨噬细胞和树突状细胞。通过刺激APCs对死亡癌细胞的吞噬和对肿瘤特异性抗原的呈递，DAMPs最终促进CD8+ T细胞的激活，从而引发细胞毒性抗肿瘤免疫反应。

尽管PDT具有诸多优势，但目前临床使用的光敏剂仍存在一些显著的局限性，包括组织穿透能力差、需要肿瘤内氧气、光敏剂选择性和生物分布不足（靶向性差）、水溶性差、清除过快或滞留时间过长。因此，迫切需要新一代光敏剂，而Ru基光敏剂由于其固有的物理化学特性，为设计新一代光敏剂提供了良好的基础。Ru基化合物具有广泛的结构修饰可能性，能够精细调节其活性，同时相比许多现有光敏剂，表现出更好的水溶性。Ru基复合物因此成为潜在的金属基抗癌药物中的重要候选者。一些研究团队近期开发了两种Ru(II)多吡啶类化合物，[Ru(DIP)?(bpy-Me)]Cl?（Ru1）和[Ru(bpy)?(bpy-styryl-OMe)]Cl?（Ru2）。这些化合物能够通过PDT产生单线态氧，并在小鼠结肠癌CT-26细胞中表现出有趣的光毒性，其IC??值在微摩尔范围内，其中一种化合物甚至在体内表现出良好的效果。因此，这两种化合物成为该研究团队的研究重点。然而，它们的精确细胞内作用机制和潜在免疫效应仍有待进一步研究。在此背景下，我们评估了这两种Ru基光敏剂在多种HPV阴性和阳性HNSCC细胞模型中的光毒性，并进一步分析了它们诱导细胞死亡、ER应激和DAMPs释放的能力。通过一种预防性抗肿瘤疫苗方法，我们展示了Ru基PDT的免疫特性。

在对Ru1和Ru2的光毒性进行分子层面研究时，我们分析了多种细胞死亡机制的标志物，重点研究了SQ20B细胞，这是一种携带TP53突变且对放疗具有高耐受性的HNSCC模型。首先，我们研究了凋亡细胞死亡的标志物，包括cleaved caspase 3、cleaved caspase 7和cleaved poly(ADP-ribose) polymerase 1（PARP1）。caspase 3和caspase 7是促凋亡的效应性caspases，而PARP1参与DNA修复，其被caspase 7切割会导致其功能丧失，从而促进凋亡。然而，在Ru1和Ru2的PDT处理中，我们未观察到caspase 3的切割。通过Western blot分析发现，在非光照条件下，SQ20B细胞中仅存在少量的caspase 7和PARP1的切割产物。但在Ru1-PDT处理后，caspase 7的切割被显著诱导，而在Ru2-PDT处理后则未观察到明显的caspase 7或PARP1的切割。这表明，只有Ru1-PDT能够通过caspase 7和PARP1的切割诱导SQ20B细胞的凋亡。

接下来，我们研究了自噬的诱导情况。自噬通过Microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3B（LC3B）的表达变化来体现。LC3B在自噬过程中从细胞质中的18 kDa形式（LC3B-I）转化为膜结合的16 kDa形式（LC3B-II），后者与自噬体相关。在非光照条件下，我们观察到LC3B-I在SQ20B细胞中均匀表达，而LC3B-II仅轻微表达。然而，在Ru1-PDT处理后，LC3B-I的表达显著减少，LC3B-II的表达则增加。同样地，Ru2-PDT处理也显示出LC3B-I的减少和LC3B-II的增加。通过计算LC3B-II/LC3B-I的比值，我们发现两种光敏剂均能够诱导自噬。

此外，我们研究了铁死亡的诱导情况。铁死亡是一种依赖铁的调控性细胞死亡，其特征是脂质过氧化和膜破裂。谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）在对抗铁死亡中起关键作用。因此，GPX4的抑制可以诱导铁死亡，这可以通过直接结合并抑制GPX4的过氧化物酶活性或间接通过谷胱甘肽耗竭来实现。我们发现，在非光照条件下，GPX4在SQ20B细胞中高度表达。然而，在Ru1和Ru2的PDT处理后，GPX4的表达显著下降，这与通过erastin和RSL3诱导的铁死亡相似。同时，通过FerroOrange和LiperFluo探针的染色，我们发现Ru1和Ru2的PDT处理能够增加细胞内的Fe2?离子和过氧化的脂质，进一步支持其诱导铁死亡的能力。

为了进一步揭示Ru基PDT的细胞死亡机制，我们研究了其对细胞内定位的影响。通过共聚焦显微镜观察，我们发现Ru1和Ru2均能够在细胞质和线粒体中定位。尽管Ru1的荧光信号强度高于Ru2，但两种化合物均与线粒体染色剂MitoTracker Green的荧光信号存在良好相关性，表明它们均能够在线粒体中积累。这种定位模式支持了线粒体ROS生成在Ru基PDT中的作用。此外，我们还研究了Ru1和Ru2对ER应激信号通路的影响，包括PERK、IRE1α和ATF6。结果显示，Ru1能够显著诱导PERK信号通路，导致eIF2α的磷酸化和ATF4的表达增加，而Ru2则表现出较弱的诱导效果。此外，Ru1还能显著诱导CHOP的表达，而Ru2则不能。这表明，Ru1比Ru2更强烈地激活了ER应激信号通路。

为了探索Ru1和Ru2的PDT是否能够激发抗肿瘤免疫反应，我们研究了它们是否能够诱导DAMPs的释放。DAMPs包括细胞膜上CRT的转运、细胞外释放的ATP和HMGB1，以及I型干扰素的诱导。我们发现，Ru1和Ru2的PDT处理均能够诱导这些DAMPs的释放，但只有Ru2的PDT处理在体内能够有效激发免疫反应。通过体外光毒性实验和体内疫苗实验，我们进一步验证了这一发现。Ru2的PDT处理能够显著提高小鼠的肿瘤无进展生存率，而Ru1的PDT处理则未能实现这一效果。这表明，尽管两种光敏剂均能够诱导DAMPs的释放，但它们的免疫效果存在显著差异。Ru2的PDT处理虽然没有诱导凋亡，但其较温和的应激反应能够有效激发免疫系统，从而实现更强的抗肿瘤免疫反应。

我们的研究结果表明，PDT的免疫效应可能不仅取决于其诱导的细胞死亡类型，还与其诱导的应激反应程度和DAMPs的释放密切相关。Ru1虽然能够诱导凋亡和ER应激，但在体内未能激发免疫反应，而Ru2虽然没有诱导凋亡，但其较温和的应激反应能够有效促进免疫系统。这一发现挑战了当前认为凋亡和ER应激是ICD必要条件的观点。因此，为了合理设计下一代光敏剂，需要重新定义ICD的诱导标准。Ru基光敏剂由于其良好的物理化学特性，如高水溶性、化学稳定性、光稳定性、大的斯托克斯位移和高单线态氧生成效率，成为PDT领域的有力候选者。此外，Ru1和Ru2均被设计用于优化光吸收特性，这为它们在PDT中的应用提供了理论基础。

总之，本研究揭示了Ru1和Ru2在HNSCC治疗中的光毒性及其对免疫反应的影响。Ru1和Ru2均能够诱导自噬和铁死亡，但只有Ru1能够诱导凋亡。尽管Ru1诱导了ER应激和DAMPs的释放，但其在体内未能激发免疫反应，而Ru2的PDT处理则表现出更强的免疫效应。这表明，PDT的免疫效应可能与细胞死亡的类型及其诱导的应激反应程度有关。因此，为了开发更有效的PDT治疗方案，需要深入研究光敏剂的细胞死亡机制和免疫效应，以选择最有可能在临床中应用的化合物。Ru基光敏剂的开发和研究为HNSCC的治疗提供了新的方向，具有广阔的应用前景。