糖尿病足溃疡患者中放线菌数量增加，初级胆酸生物合成途径被上调

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Increased abundance of actinobacteria and upregulation of primary bile acid biosynthesis in diabetic foot ulcers

糖尿病足（DF）患者动脉微生物群多样性显著降低，与动脉粥样硬化（AS）患者聚类更近，且均存在初级胆酸合成代谢通路上调。关键属包括Corynebacterium、Streptophyta_Group等，提示靶向胆酸代谢或成DF治疗新方向。

　　糖尿病足（DF）是一种严重的糖尿病并发症，通常伴随着高风险的截肢需求，其病理机制复杂，涉及多种因素的相互作用。近年来，随着微生物组研究的深入，越来越多的证据表明，微生物群落的变化可能在DF的发展和恶化中扮演重要角色。然而，关于DF患者动脉微生物群落的研究仍然较少。本研究首次系统地分析了DF患者的动脉微生物组成，并与动脉粥样硬化（AS）患者及因外伤接受截肢的健康对照组（C）进行了比较，旨在揭示动脉微生物群落如何影响DF的进展。

### 研究背景

DF的形成通常与血糖控制不佳、血管病变、神经病变以及感染密切相关。其中，动脉粥样硬化作为DF的重要病理基础，对DF的发生和恶化具有显著影响。长期高血糖会损害血管内皮功能，引发血流动力学异常，导致血管壁增厚和动脉粥样硬化斑块的形成。这种血管损伤会进一步限制下肢的血供，造成组织缺氧和代谢紊乱，为DF溃疡的发生和感染提供了病理基础。DF溃疡的快速扩散不仅给临床治疗带来挑战，还可能引发严重的并发症，如坏疽和截肢。

尽管已有大量研究聚焦于DF溃疡部位的微生物群落，但这些研究往往受到采样方法和污染的限制，难以准确反映病原体的组成及抗生素使用的指导意义。值得注意的是，DF相关的微生物并不仅限于溃疡部位，血管内微生物的变化也可能在DF的发展中起到关键作用。已有研究发现，动脉粥样硬化斑块中存在多种微生物，这些微生物通过诱导炎症反应促进动脉粥样硬化的进展。因此，探索DF患者动脉微生物的组成及其潜在功能，有助于更全面地理解DF的发病机制，并为新的治疗策略提供依据。

### 研究方法

本研究共纳入22例动脉组织样本，包括11例DF患者、7例AS患者以及4例因外伤接受截肢的健康对照者。所有样本均在严格无菌条件下采集，并通过16S rRNA基因测序技术进行分析。样本采集后，立即用液氮冷冻保存，以防止微生物活性变化。为确保测序的准确性，采用了CTAB法提取微生物DNA，并使用Qubit荧光计进行定量分析。随后，通过PCR扩增多个高变区（V2、V3、V5、V6和V8）以提高数据的分辨率。

测序数据经过一系列处理步骤，包括低质量序列去除、条形码修剪和引物移除。使用fqtrim软件对数据进行质量过滤，保留质量分数高于20且长度超过100 bp的序列。不同区域的测序数据被整合分析，并利用SILVA 138数据库进行分类注释。通过QIIME2平台计算α多样性（如Chao1、ACE、Shannon和Pielou指数）和β多样性（如基于加权UniFrac距离的主坐标分析PCoA），以比较不同组别之间的微生物多样性及群落结构差异。

为减少污染风险，研究过程中引入了空白对照组，包括提取空白、PCR阴性对照和测序空白，并采用DADA2算法进行序列处理，包括严格的错误校正和嵌合体去除，以确保数据的可靠性。此外，通过LEfSe分析识别了DF组中显著富集的微生物类群，并结合PICRUSt2工具对微生物群落的功能潜力进行了预测，进一步分析了不同组别之间的功能差异。

### 研究结果

α多样性分析显示，DF组的微生物多样性显著低于AS组和C组。这表明DF患者的动脉微生物群落可能存在一定程度的失调。β多样性分析则显示，DF组和AS组的样本在PCoA图中聚类较为紧密，而与C组相比则表现出显著的差异。这种差异可能反映了DF和AS在微生物组成上的相似性，以及与健康个体之间的显著不同。

在门水平上，DF组和AS组均表现出Actinobacteria的显著富集，而TM6在DF组中减少，Proteobacteria在AS组中也有所下降。进一步的LEfSe分析发现，DF组中显著富集的菌属包括*Corynebacterium*、*Streptophyta_Group*、*Caulobacter*、*Hydrogenophaga*和*Diaphorobacter*。这些菌属可能在DF的进展中发挥重要作用，特别是*Corynebacterium*，其已被证明可以促进炎症、细胞凋亡和焦亡，从而抑制DF溃疡的愈合。此外，其强大的生物膜形成能力可能与慢性溃疡的形成有关。

在功能预测方面，KEGG分析显示，DF组和AS组在一级和二级功能路径上均表现出显著的代谢变化。例如，DF组和AS组的代谢和生物系统路径显著上调，而细胞过程和环境信息处理路径则下调。在三级功能路径分析中，DF组显示出氨基酸糖和核苷酸糖代谢的显著下调，以及初级胆汁酸生物合成的显著上调。这些变化可能与DF的进展密切相关，尤其是初级胆汁酸生物合成的异常可能通过激活NLRP3炎症小体，引发全身性的慢性低度炎症，从而加剧局部组织损伤。

### 研究讨论

本研究的发现表明，DF患者的动脉微生物群落存在显著的失调现象。α多样性分析显示，DF组的微生物多样性低于健康对照组，这一现象可能反映了DF的进展过程中微生物群落的破坏和不平衡。同时，β多样性分析显示，DF组和AS组在微生物组成上表现出一定的相似性，这可能与两者共享的病理特征有关。然而，值得注意的是，这些变化并不完全局限于DF本身，而是可能与动脉粥样硬化的病理状态密切相关。

在门水平上，Actinobacteria的增加可能是一个普遍现象，不仅出现在DF患者中，也出现在AS患者中。这提示我们，Actinobacteria的富集可能并非DF特有，而是与动脉粥样硬化这一更广泛的病理过程有关。此外，TM6在DF组中的减少可能反映了该菌门在DF进展中的特定作用，而Proteobacteria在AS组中的减少则可能与动脉粥样硬化的进展相关。

在菌属水平上，DF组中显著富集的*Corynebacterium*可能在DF溃疡的形成和恶化中起到关键作用。其通过促进炎症反应和生物膜形成，可能对DF的愈合产生负面影响。而其他菌属如*Streptophyta_Group*、*Caulobacter*、*Hydrogenophaga*和*Diaphorobacter*的功能仍需进一步研究，以明确其在DF中的具体作用。这些菌属可能通过不同的代谢途径影响宿主的免疫反应，进而加剧炎症和组织损伤。

在功能路径分析中，DF组和AS组均表现出代谢路径的显著上调，特别是氨基酸代谢和脂质代谢。这些变化可能与炎症反应的激活有关，因为异常的氨基酸代谢已被证明与胰岛素抵抗和动脉粥样硬化的进展密切相关。例如，支链氨基酸代谢的紊乱可能通过增加活性氧和炎症反应导致内皮功能障碍，而苯丙氨酸代谢的异常可能诱导促炎性巨噬细胞极化，从而加剧炎症状态。此外，脂质代谢的异常可能导致氧化脂质的积累和内质网应激，进一步激活炎症反应，加速动脉粥样硬化的进展。

在三级功能路径分析中，DF组显示出氨基酸糖和核苷酸糖代谢的显著下调，以及初级胆汁酸生物合成的显著上调。这些变化可能与DF溃疡的延迟愈合有关。初级胆汁酸生物合成的异常可能通过激活NLRP3炎症小体，引发全身性的慢性低度炎症，从而加重局部组织损伤。此外，氨基酸糖和核苷酸糖代谢的紊乱可能影响糖代谢，进而导致DF患者的代谢紊乱，影响组织修复能力。

### 研究意义与未来方向

本研究首次系统地分析了DF患者的动脉微生物组成，并与AS患者和健康对照组进行了比较。研究结果表明，DF患者的动脉微生物群落存在显著的失调现象，特别是在Actinobacteria的富集和初级胆汁酸生物合成的上调方面。这些发现不仅有助于理解DF的发病机制，还可能为DF的治疗提供新的方向。

尽管本研究的样本量较小，且健康对照组的样本数量有限，但所获得的统计学结果仍具有重要的机制意义。未来的研究需要进一步扩大样本量，并结合更全面的实验验证，以确认这些微生物和代谢路径在DF中的具体作用。此外，研究还应关注不同微生物之间的相互作用及其对宿主免疫系统的潜在影响，以揭示更复杂的机制网络。

综上所述，DF患者的动脉微生物群落变化可能与疾病进展密切相关，而Actinobacteria和初级胆汁酸生物合成的异常可能是其潜在的治疗靶点。通过调节这些关键的微生物和代谢路径，可能有助于缓解DF相关的慢性炎症和组织损伤，从而改善DF的预后。未来的研究应进一步探索这些微生物的功能及其在DF中的具体作用，以期为DF的治疗提供更坚实的科学依据。