通过网络药理学、生物信息学分析和细胞实验，鉴定并验证与icaritin相关的肝癌预后基因

《Frontiers in Immunology》：Identification and validation of icaritin-associated prognostic genes in hepatocellular carcinoma through network pharmacology, bioinformatics analysis, and cellular experiments

本研究通过整合网络药理学、生物信息学分析和体外实验，系统揭示了Icaritin（ICT）在肝细胞癌（HCC）中的多靶点作用机制及预后价值。基于数据库筛选和WGCNA分析，共鉴定35个ICT相关差异表达基因，功能富集分析显示其核心靶点涉及细胞周期调控和糖酵解代谢。通过机器学习模型筛选出四个核心预后基因（UCK2、FABP5、CA9、CYP2C9），构建的四基因风险评分模型可显著分层HCC患者生存状态。分子对接和动力学模拟证实ICT与核心靶点蛋白稳定结合，体外实验验证了ICT通过剂量依赖性抑制HCC细胞增殖、迁移及调控靶基因表达，且与索拉非尼敏感性呈正相关。研究为ICT治疗HCC提供了分子机制和预后标志物依据。

　　肝细胞癌（HCC）是全球范围内的主要健康问题之一，具有较差的临床预后和较低的生存率。作为中药来源的活性成分，伊卡里丁（ICT）在HCC治疗中表现出多靶点抗肿瘤特性，并且具有潜在的临床应用价值。然而，ICT抗肿瘤作用的具体分子机制仍未完全阐明。因此，本研究采用整合策略，结合生物信息学分析、实验验证和网络药理学方法，系统地探讨ICT相关基因在HCC中的预后和治疗意义。通过这种多学科融合的分析方法，不仅揭示了ICT可能的作用机制，还为开发基于天然化合物的新型治疗方案提供了理论依据和实验支持。

### 研究背景与意义

肝癌是全球第六大常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因。其中，HCC占所有原发性肝癌病例的80%至90%，其预后通常较差，5年生存率仅为12%左右，给全球公共卫生带来了沉重负担。在中国，HCC病例占全球近一半，表明该疾病在某些地区具有更高的发生率。HCC的病因包括慢性肝病、病毒性肝炎、肝硬化和酒精滥用等。目前，手术切除仍然是HCC治疗的主要手段，但因为早期HCC常常无症状或具有非特异性临床表现，仅有不到30%的患者在确诊时可以接受根治性手术。对于晚期HCC，系统性治疗如仑伐替尼和索拉非尼被推荐，但这些药物的临床疗效往往受到治疗耐药性、疾病进展和长期药物相关毒性的影响，从而限制了治疗效果。即使手术成功，许多患者仍面临较高的复发和转移风险，导致长期生存率持续低迷。这些挑战凸显了开发更安全、更有效的治疗策略的迫切需求。

近年来，传统中药及其天然化合物在HCC治疗中的潜力逐渐受到关注。这些化合物不仅能够减少治疗相关毒性，还能增强治疗效果、抑制肿瘤复发、改善患者生活质量并延长总体生存期。ICT作为一种从中药植物Epimedium中提取的预酰化黄酮类化合物，已被证实对HCC及其他多种恶性肿瘤具有显著的抗肿瘤活性。ICT的抗癌作用主要通过调控多个信号通路实现，包括ERK/ULK1/NCOA4、IL-6/JAK2/STAT3和ER-α36等通路。此外，ICT在临床试验中表现出良好的耐受性，具有较少的不良反应，并且能够改善HCC患者的生存预后，延迟疾病进展，带来重要的临床益处。同时，ICT还能通过调节关键免疫细胞的表型和功能，如髓源性抑制细胞（MDSCs）和CD8+ T细胞，增强抗肿瘤免疫反应。

然而，ICT的抗HCC作用的分子机制仍未完全阐明。网络药理学作为一种整合性方法，能够构建“药物-靶点-通路-疾病”网络，系统分析复杂的生物相互作用，从而揭示中药多靶点协同作用的特性。本研究结合网络药理学和生物信息学方法，识别ICT在HCC中可能作用的核心基因，并评估其预后意义。通过分子对接和动力学模拟等计算方法，预测ICT与潜在靶点蛋白的结合亲和力和稳定性。最后，通过体外实验验证ICT对HCC细胞增殖、迁移以及核心靶点基因表达的影响，从而进一步支持其治疗潜力。

### 研究方法

本研究采用了一种整合性的研究方法，涵盖多个步骤和不同的技术手段。首先，通过系统搜索多个公共数据库（如CTD、TCMSP和HERB），识别ICT可能的靶点基因。此外，ICT的SMILES格式和三维结构也从PubChem数据库中获取，并通过Swiss Target Prediction和PharmMapper平台进一步预测其靶点。综合多个数据库的结果，最终筛选出406个独特的ICT相关靶点。

对于HCC相关基因的识别，研究团队通过查询GeneCards和OMIM数据库，使用“hepatocellular carcinoma”和“HCC”作为关键词，获得了大量的HCC相关基因。其中，GeneCards数据库中只选择相关性评分≥2.0的基因作为高可信度的候选基因。通过整合这些数据库的基因集，并去除重复，最终获得了7000个非重复的HCC相关基因。通过Venn图分析，研究者识别了ICT和HCC之间的35个重叠靶点，并构建了ICT靶点-疾病网络，用于后续的网络分析和功能研究。

为了进一步分析这些重叠靶点的功能，研究团队进行了基因功能富集分析（FEA），利用GO和KEGG通路分析方法，揭示这些基因主要参与细胞周期调控和糖酵解等关键生物学过程。这些发现为ICT的抗肿瘤作用提供了潜在的分子机制依据。此外，通过构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，研究团队进一步探讨了这些靶点之间的相互作用关系，并通过筛选具有高度拓扑重要性的节点，确定了可能的核心靶点。

为了建立ICT相关的预后模型，研究团队采用了多种机器学习算法，包括支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）、XGBoost、高斯混合模型（GMM）和随机森林（RF）。通过这些算法的整合，研究者识别出六种具有预后意义的基因，并进一步通过Kaplan-Meier（K-M）生存分析和LASSO Cox回归分析，筛选出四种核心基因（UCK2、FABP5、CA9和CYP2C9），并构建了一个风险评分模型。该模型能够有效区分HCC患者为高风险和低风险群体，并通过时间依赖的ROC曲线分析评估其预测性能。结果显示，该模型在1、3和5年生存预测中表现出一定的准确性。

此外，研究团队还进行了药物敏感性和免疫浸润分析，以评估ICT对HCC细胞对药物反应的影响以及其对免疫微环境的调控作用。通过“oncoPredict”R包分析药物敏感性，发现这四个核心基因与索拉非尼的敏感性之间存在显著关联。其中，CYP2C9的表达与索拉非尼敏感性呈正相关，而UCK2、FABP5和CA9的表达则与索拉非尼敏感性呈负相关。这些结果表明，ICT可能通过调控这些基因，间接影响HCC细胞对药物的反应性。

为了验证ICT与核心靶点之间的直接相互作用，研究团队进行了分子对接分析。结果显示，ICT与CA9、UCK2、FABP5和CYP2C9之间的结合能均低于-7 kJ/mol，表明这些靶点与ICT之间存在稳定的结合关系。为了进一步验证结合的稳定性，研究团队还进行了分子动力学（MD）模拟，分析ICT与这些靶点的相互作用。模拟结果表明，ICT与这些靶点形成的复合物在模拟过程中保持了相对稳定的构象，且氢键相互作用在时间上具有持续性，说明ICT对这些靶点具有较强的调控能力。

### 研究结果

通过整合生物信息学和实验验证，研究团队发现ICT能够显著抑制HCC细胞的增殖和迁移。体外实验显示，ICT在不同浓度下对HepG2和Huh7细胞的增殖具有剂量依赖性抑制作用。例如，在HepG2细胞中，0、7.5、15和30 μM的ICT分别导致细胞存活率下降至53%、50%、44%和36%。在Huh7细胞中，0、5、10和20 μM的ICT分别使细胞迁移率降至48%、40%、28%和16%。这些结果支持ICT通过调控关键生物学通路抑制HCC细胞增殖和迁移的假设。

此外，ICT对CA9、UCK2、FABP5和CYP2C9这四个核心靶点的表达具有显著影响。通过定量免疫荧光分析和qRT-PCR实验，研究团队发现ICT能够显著下调CA9、UCK2和FABP5的表达，同时显著上调CYP2C9的表达。这些结果表明，ICT可能通过调控这些关键代谢相关基因，实现对HCC的多靶点抑制作用。其中，CA9在HCC中被发现具有较高的表达水平，并且其表达与较差的预后密切相关。ICT通过下调CA9的表达，可能抑制HCC细胞的侵袭性和迁移能力，从而发挥抗肿瘤作用。

UCK2和FABP5在HCC组织中也表现出显著的高表达，而CYP2C9则表现出较低的表达。这些基因的表达变化与HCC的进展密切相关。例如，UCK2的高表达与较差的预后有关，且其在HCC中可能通过激活STAT3、Wnt/β-catenin和EGFR-AKT等关键信号通路促进肿瘤生长和转移。ICT通过抑制UCK2的表达，可能在一定程度上干扰这些通路，从而抑制HCC的进展。FABP5则作为脂质代谢的关键调节因子，其高表达与HCC的不良预后相关。ICT通过下调FABP5的表达，可能干扰脂质代谢，从而抑制HCC细胞的恶性表型。

CYP2C9作为参与多种致癌物和药物代谢的酶，在HCC组织中表现出较低的表达。ICT通过上调CYP2C9的表达，可能帮助恢复肝细胞的分化功能，或者间接抑制肿瘤生长。这些结果表明，ICT通过抑制促癌基因（如CA9、UCK2和FABP5）并上调潜在抑癌基因（如CYP2C9），可能在HCC治疗中发挥重要作用。

### 讨论与结论

本研究通过整合计算生物学和实验验证，揭示了ICT在HCC治疗中的潜在分子机制。ICT可能通过调控关键信号通路（如细胞周期调控和代谢重编程）抑制HCC的进展，并通过多靶点作用机制影响肿瘤生物学特性。ICT对CA9、UCK2和FABP5的下调作用可能通过干扰细胞增殖、迁移和代谢，从而抑制肿瘤生长。同时，ICT对CYP2C9的上调作用可能有助于恢复肝细胞的正常功能，或者间接抑制肿瘤发展。

此外，ICT可能通过调控免疫微环境，影响HCC患者的预后。研究发现，ICT相关的风险评分模型与免疫细胞浸润水平密切相关。例如，该模型与M0巨噬细胞和调节性T细胞（Tregs）的浸润呈正相关，而与M1巨噬细胞和单核细胞的浸润呈负相关。这表明ICT可能通过调控这些免疫细胞，改善HCC的免疫微环境，从而增强抗肿瘤免疫反应。

尽管本研究提供了ICT在HCC治疗中的分子机制支持，但仍存在一些局限性。例如，目前缺乏体内实验数据来验证ICT对CA9、UCK2、FABP5和CYP2C9的调控作用是否能够在活体模型中重现，以及ICT是否能够重塑HCC的免疫微环境。未来的研究应结合免疫功能完整的动物模型，进一步验证ICT的体内作用机制，并推动其临床转化。

综上所述，本研究通过整合计算生物学和实验验证，系统地揭示了ICT在HCC治疗中的潜在作用机制。ICT可能通过调控多个关键基因（如CA9、UCK2、FABP5和CYP2C9），实现对HCC细胞增殖、迁移和代谢的抑制作用。这些发现不仅为ICT在HCC治疗中的应用提供了理论依据，也为开发基于天然化合物的新型治疗策略提供了新的思路。未来的研究应进一步探索ICT的体内作用机制，并结合临床试验，评估其在HCC治疗中的实际应用价值。