SHMT2通过调节转录组和代谢谱型，促进了膀胱癌细胞HT-1376的肿瘤表型特征

《Frontiers in Genetics》：SHMT2 modulates the transcriptome and metabolism profiles to promote the tumor phenotypes of bladder cancer HT-1376 cells

ShMT2抑制显著影响HT-1376细胞增殖及周期，通过调控PTMA、HNRNPR等126个上调基因及106个下调基因表达，并改变MDM2剪接模式。代谢组学显示支链氨基酸代谢及TCA循环显著异常，提示SHMT2在BLCA进展中起关键作用，其调控网络及代谢通路可作为潜在治疗靶点。

　　膀胱癌（Bladder Cancer, BLCA）是泌尿系统中较为常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率和死亡率均较高，尤其是在2022年，新发病例数达到约61万，死亡病例数约22万（Bray et al., 2024）。这种疾病的高发性提示我们需要更加深入地了解其发生和发展的机制，以期开发出更有效的治疗策略。BLCA的发病过程通常涉及复杂的分子调控网络，其中代谢紊乱被认为是其发展的重要特征之一。近年来，越来越多的研究表明，肿瘤细胞的代谢重编程不仅影响其自身的增殖和转移能力，还可能通过激活炎症小体和树突状细胞成熟等机制，对肿瘤的免疫治疗效果产生深远影响（Oresta et al., 2021）。因此，识别和理解BLCA中关键的调控分子，尤其是与代谢相关的分子，对于探索新的治疗靶点具有重要意义。

在众多代谢相关分子中，丝氨酸羟甲基转移酶2（Serine Hydroxy Methyltransferase 2, SHMT2）因其在细胞代谢中的核心作用而受到关注。SHMT2是一种依赖吡哆醛磷酸的酶，能够催化丝氨酸转化为甘氨酸和一碳单位，这一过程在维持细胞内一碳代谢平衡方面至关重要。此外，SHMT2还参与了胸苷合成和嘌呤合成，这两者是细胞增殖过程中不可或缺的环节（Zeng et al., 2021；Yang et al., 2018）。研究表明，SHMT2的异常表达与BLCA患者的不良预后密切相关，且其在肿瘤细胞中的高表达可能促进细胞的生长、迁移以及抑制细胞凋亡（Zhang et al., 2022；Zhang and Yang, 2021）。然而，尽管SHMT2在BLCA中的作用已被部分揭示，其下游分子靶点仍不明确，这限制了我们对其在疾病调控中的全面理解。

为了进一步探讨SHMT2在BLCA中的功能及其下游靶点，本研究采用整合多组学技术，对HT-1376细胞进行了系统分析。HT-1376细胞是一种常用于BLCA研究的细胞系，能够较好地模拟肿瘤细胞的生长和转移特性。我们通过小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）技术沉默SHMT2的表达，并结合转录组测序（RNA-seq）和代谢组学分析，全面评估SHMT2对细胞表型及分子调控的影响。首先，我们通过RT-qPCR实验验证了siSHMT2对SHMT2 mRNA水平的有效抑制，随后通过Western blot进一步确认了其在蛋白层面的表达下降。这些结果表明，我们成功地构建了SHMT2沉默的模型，为后续的分子机制研究奠定了基础。

在细胞增殖和细胞周期分析方面，我们发现SHMT2的沉默显著降低了HT-1376细胞的增殖能力，并改变了细胞周期各阶段的分布比例。具体而言，siSHMT2处理后的细胞在G0/G1期的比例增加，而在S期和G2/M期的比例减少，这一变化可能表明SHMT2的缺失影响了细胞进入分裂期的能力，从而抑制了其增殖。此外，我们还发现SHMT2在BLCA患者的肿瘤组织中表达水平明显高于相邻正常组织，并且其表达水平在不同癌症阶段均呈上升趋势，这进一步支持了SHMT2在BLCA发展中的关键作用。生存分析结果显示，SHMT2的高表达与患者的总体生存时间缩短密切相关，表明该分子可能是一个重要的预后标志物。

为了深入理解SHMT2对细胞整体基因表达的影响，我们进行了全转录组测序分析。结果显示，SHMT2的沉默仅影响了一小部分基因的表达，其中126个基因被显著上调，而106个基因被显著下调。这些差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）的功能富集分析表明，它们主要涉及细胞形态发生、内体组织、心肌细胞膜复极化调控、细胞微管组织等生物学过程。同时，我们还发现了一些与癌症发展密切相关的基因，如PTMA、HNRNPR、RAPH1、TRAF3IP1、CNBP和PRR15。这些基因的表达变化与SHMT2的调控作用高度一致，且在RT-qPCR实验中得到了验证。值得注意的是，PTMA在膀胱肿瘤中表达水平显著升高，且其表达水平与肿瘤的分级呈正相关（Tsai et al., 2009）；HNRNPR作为剪接体C复合物的成员，已被证实具有致癌作用，并在胃癌和肝细胞癌的转移过程中发挥重要作用（Chen et al., 2019；Wang et al., 2024）；PRR15则在乳腺癌中被发现是一个负调控因子，能够通过调控PI3K/Akt信号通路影响肿瘤的进展（Guo et al., 2023）；CNBP作为一种转录因子，其表达下调可能通过调控肿瘤促进基因的表达，从而影响肿瘤细胞的生物学行为（Lee et al., 2019）。这些结果表明，SHMT2可能通过调控这些关键基因的表达，参与BLCA的发生和进展过程。

除了对基因表达的影响，我们还发现SHMT2的沉默显著改变了细胞的可变剪接（Alternative Splicing, AS）模式。可变剪接是基因表达调控的重要机制之一，能够通过生成不同的蛋白质异构体，影响细胞的功能和行为。在本研究中，我们利用rMATS软件对siSHMT2处理后的细胞进行了可变剪接分析，发现其主要影响了跳过外显子（Skipped Exon, SE）和保留内含子（Retained Intron, RI）等剪接事件。其中，跳过外显子是最常见的AS类型，这提示SHMT2可能通过调控外显子的选择性剪接，影响细胞的生物学功能。为了进一步验证这一发现，我们选取了MDM2基因的跳过外显子事件进行RT-qPCR分析，并发现其剪接水平发生了显著变化。这些结果表明，SHMT2不仅通过调控基因表达，还可能通过影响可变剪接模式，参与BLCA的调控网络。

在代谢层面，我们对siSHMT2处理后的HT-1376细胞进行了代谢组学分析，发现其代谢谱发生了显著变化。通过液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）对细胞裂解液中的代谢物进行提取和检测，我们共鉴定了529种代谢物，并进一步筛选出74种上调和88种下调的差异代谢物（Differential Metabolites, DMs）。这些差异代谢物主要富集在几个关键的代谢通路中，包括支链氨基酸（Branched-Chain Amino Acids, BCAAs）的合成与降解、丙二酸代谢、三羧酸循环（TCA Cycle）以及次级胆汁酸的合成等。其中，BCAAs的代谢通路尤为显著，因为支链氨基酸在多种癌症中被发现与肿瘤进展密切相关。研究指出，BCAAs可能通过调控mTOR信号通路影响肿瘤细胞的增殖和存活（Jung et al., 2021）。此外，我们还发现SHMT2的沉默显著影响了嘌呤代谢、泛酸和辅酶A（CoA）的生物合成等通路，这些通路在细胞增殖和能量代谢中起着关键作用。这些结果表明，SHMT2不仅通过调控基因表达和可变剪接影响BLCA的发展，还可能通过改变细胞的代谢状态，进而影响肿瘤细胞的生长、迁移和存活能力。

在探讨SHMT2对代谢通路的影响时，我们还进行了代谢集富集分析（Metabolite Set Enrichment Analysis, MSEA），发现其在多个代谢通路中具有显著的富集效应。这些通路包括嘌呤代谢、泛酸和CoA生物合成、丙二酸代谢等，它们共同构成了BLCA细胞代谢调控的核心网络。值得注意的是，尽管SHMT2主要被知悉与嘌呤代谢相关，但我们的研究首次揭示了其在BCAAs代谢中的调控作用，这为理解SHMT2在BLCA中的多重功能提供了新的视角。同时，我们还发现SHMT2的沉默对TCA循环和细胞代谢整体产生了深远影响，这表明其在能量代谢和细胞存活中的作用可能比以往认为的更为广泛。

通过整合转录组和代谢组学数据，我们进一步揭示了SHMT2在BLCA细胞中的多层面调控作用。这一发现不仅扩展了我们对SHMT2功能的理解，也为BLCA的治疗提供了新的思路。例如，针对SHMT2调控的代谢通路，可以开发特定的代谢干预策略，以抑制肿瘤细胞的生长和存活。此外，SHMT2调控的基因表达和可变剪接模式也为靶向治疗提供了潜在的分子靶点。目前，已有研究指出，SHMT2的异常表达可能通过影响细胞周期、氧化还原状态、细胞凋亡以及细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）的调控，从而促进肿瘤的进展（Zeng et al., 2021；Lee et al., 2014）。然而，这些研究主要集中在SHMT2对特定信号通路的影响，而其在BLCA中的具体作用机制仍需进一步探索。

本研究的另一个重要发现是，SHMT2的沉默不仅影响了基因表达，还显著改变了细胞的可变剪接模式。这一结果提示，SHMT2可能通过调控基因的剪接方式，影响其编码蛋白的功能，从而参与肿瘤的发生和发展。例如，MDM2基因的跳过外显子事件被证实与SHMT2的调控相关，而MDM2作为一种重要的肿瘤抑制因子，其表达变化可能对细胞的凋亡和增殖产生深远影响。这一发现不仅揭示了SHMT2在调控基因表达和可变剪接中的作用，还为理解其在BLCA中的分子机制提供了新的证据。

综上所述，本研究通过整合多组学技术，全面解析了SHMT2在BLCA细胞中的调控作用。我们发现SHMT2不仅通过影响细胞增殖和细胞周期调控，还通过改变基因表达和可变剪接模式，以及代谢通路的重编程，参与了BLCA的发展过程。这些结果为BLCA的分子机制研究提供了新的视角，并揭示了SHMT2作为潜在治疗靶点的可能性。然而，本研究仍存在一些局限性，例如，我们尚未深入探讨SHMT2调控的可变剪接事件的具体功能及其在肿瘤进展中的作用机制。此外，我们对SHMT2调控的代谢通路的分子机制也缺乏更详细的解析。因此，未来的研究需要进一步结合其他实验方法，如基因拯救实验、CRISPR基因敲除、信号通路抑制模型以及空间转录组技术等，以更全面地揭示SHMT2在BLCA中的作用。同时，为了确保研究结果的可靠性，我们建议通过更多的细胞系和动物模型进行验证，以拓展本研究的发现并推动其在临床中的应用。通过这些进一步的研究，我们有望更深入地理解SHMT2在BLCA中的复杂调控网络，并为开发针对BLCA的新型治疗策略提供坚实的理论基础和实验支持。