基于农杆菌T-DNA右边界保守序列的生物信息学管道开发及其在转基因植物筛查中的应用

《Journal of Consumer Protection and Food Safety》：Retrieving sequences of genetically modified plants from public databases to widen screening approaches

本研究针对现有转基因生物(GMO)序列数据库覆盖不全的问题，开发了一种从公共数据库检索新GMO序列的生物信息学管道。研究人员利用农杆菌介导转化中保留的25 bp Ti质粒保守序列作为分子探针，成功鉴定了23种GMO的完整序列，并基于此开发了新型实时PCR筛查方法At2。该方法展现出良好的灵敏度(LOD95%为2.59拷贝)和特异性，可检测13种欧盟未授权的GMO，为转基因食品饲料的监管提供了新工具。

　　

随着全球转基因作物种植面积的不断扩大，转基因食品饲料的安全监管面临严峻挑战。欧盟法规(EC) No 1830/2003要求对转基因生物进行全链条可追溯管理，而实时PCR技术因其高灵敏度、特异性成为主流的检测手段。然而，现有筛查方法的有效性高度依赖于完整的GMO序列数据库支持。欧盟联合研究中心(JRC)虽建立了GMO序列数据库，但据生物安全信息交换所(BCH)数据显示，全球大多数食用、饲用转基因生物序列尚未被收录，这严重制约了检测方法的覆盖范围。

传统筛查方法主要针对通用遗传元件，但许多未授权GMO的序列信息分散在不同专利文件中，且缺乏规范注释。农杆菌介导转化是植物转基因的主流技术，其T-DNA右边界(RB)附近存在一段高度保守的25 bp序列。日本学者Takabatake等人2020年发现该序列在不同转基因植物中高度保守，但其所开发的终点PCR检测方法在灵敏度与操作性方面存在局限。因此，开发基于该区域的新型实时PCR筛查方法具有重要应用价值。

为解决上述问题，M. Colaiacovo等研究人员在《Journal of Consumer Protection and Food Safety》发表研究，通过构建生物信息学管道从公共数据库挖掘新GMO序列。该研究以25 bp保守序列为起点，通过三级筛选策略（植物关联序列筛选、人工序列筛选、专利数据库扩展搜索），最终获得34个GMO的完整序列，其中18个为欧盟未授权事件。作为概念验证，团队基于序列聚类分析中最大的A组保守区域，设计了靶向86 bp片段的At2实时PCR方法。

关键技术方法包括：1）基于BLAST的生物信息学管道构建，用于筛选NCBI非冗余核苷酸(nt)、专利(patnt)及Addgene载体数据库；2）数字PCR(dPCR)优化反应体系；3）概率检测(POD)模型评估方法检测限(LOD_95%)；4）体外特异性验证使用13种转基因作物及6种常规作物DNA样本。

3.1 植物关联序列筛选

通过严格筛选公共数据库中获得3,087条专利序列和236条植物序列，经去重和人工核查后锁定27个GMO序列。多重比对显示这些序列可基于RB侧翼序列相似性分为5个组别，其中A组包含最多序列且保守性最高。

3.2 人工序列筛选

从人工序列库中识别出2,328条含目标序列的记录，通过侧翼区域比对归类为2个合成序列组，为后续扩展搜索提供查询模板。

3.3 专利数据库扩展搜索

使用代表性序列进行二次搜索，新增7个GMO序列。累计获得34个GMO完整序列，其中12个为JRC数据库未收录的未授权事件。

3.4 实时PCR方法开发

基于A组保守区域设计At2方法，其引物和探针（表3）靶向78 bp扩增子。dPCR验证显示单拷贝特性，与玉米单拷贝内参基因hmg表现一致。

3.5 方法特异性

体外实验表明At2方法可特异性检测含目标序列的转基因玉米（SYN-IR162-4等）、棉花（SYN-IR102-7）样本，而对粒子轰击法转化的MON-810及常规作物无交叉反应。

3.6 方法灵敏度

梯度稀释实验显示At2方法的LOD_95%为2.59拷贝（95% CI: 1.59-4.14），符合欧洲转基因检测实验室网络(ENGL)要求。POD模型参数λ=1.12证实PCR效率良好。

3.7 检测潜力评估

生物信息学分析预测At2方法可覆盖4种欧盟授权、2种审批中及13种未授权GMO，包括低酚棉TAM-66274-5、抗虫茄子EE-6726等具有贸易潜力的品系。

本研究成功构建了从公共数据库挖掘GMO序列的系统性策略，突破了传统数据库的覆盖局限。所开发的At2筛查方法实现了对农杆菌转化GMO的高通量检测，尤其为未授权事件的监管提供了新技术支撑。该生物信息学管道可扩展至其他转基因常用元件（如病毒启动子、筛选标记基因），为应对新型转基因产品的检测挑战提供了可推广的研究范式。随着转基因技术的迭代发展，此类基于序列挖掘的筛查策略将在保障食品链安全方面发挥越来越重要的作用。