南海永乐蓝洞汞甲基化微生物群落的多维生态位研究揭示新型汞甲基化机制

《Marine Life Science & Technology》：Metagenomics reveals diverse community of putative mercury methylators across different biogeochemical niches in Sansha Yongle blue hole

本研究针对海洋环境中甲基汞(MeHg)形成机制不清的问题，通过宏基因组学技术系统解析了全球最深蓝洞——永乐蓝洞(YBH)不同氧化还原梯度下汞甲基化微生物(hgcA基因携带者)的多样性、分布及生态适应策略。研究发现蓝洞深部缺氧硫化水体是汞甲基化热点区域，以多样的δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)为主导；亚氧化中层则以硝化刺菌(Nitrospina)和粘球菌门(Myxococcota)为主。研究首次揭示了汞甲基化微生物在自由生活(FL)和颗粒附着(PA)两种生活方式下的生态位分化，并证实沉降颗粒在促进汞甲基化中的关键作用。该成果为理解海洋汞循环提供了新视角，确立蓝洞作为研究分层生态系统汞生物地球化学过程的天然实验室。

　　

在浩瀚的海洋深处，隐藏着一种看不见的健康威胁——甲基汞(MeHg)。这种强效神经毒素能够通过食物链富集，最终危及人类健康。历史上最著名的汞中毒事件发生在20世纪50年代的日本水俣市，导致数百人死亡。虽然科学家早已知道微生物能将无机汞(Hg)转化为甲基汞，但这一过程在海洋环境中的具体机制，尤其是在低氧水体中的发生规律，至今仍是未解之谜。

近年来，研究发现海洋低氧区域，如氧最小区(OMZs)，可能是甲基汞形成的重要场所。然而，由于海洋环境的复杂性，确定甲基汞产生的主要位置（亚氧化层还是缺氧层）仍存在争议。更令人困惑的是，传统认为汞甲基化主要是由厌氧细菌完成的，但越来越多的证据表明，在含氧量较低的水体中也存在甲基汞的形成。

面对这些挑战，研究人员将目光投向了海洋中的天然实验室——"蓝洞"。这些海洋落水洞形成于末次冰期，通常存在于当前海平面以下100-200米处。蓝洞内部光合作用产氧有限，垂直混合不充分，形成了独特的氧化还原梯度，是研究微生物驱动生物地球化学循环的理想场所。

位于中国南海的永乐蓝洞(YBH)是目前已知全球最深的蓝洞，深度达301米，几乎比第二深的蓝洞（巴哈马长岛的迪恩蓝洞）深100米。永乐蓝洞具有明显的氧化还原分层：表层水体溶解氧(DO)接近饱和，中间层为亚氧化环境，而100米以下则为完全缺氧且富含硫化物的水体。这种独特的化学特征使永乐蓝洞成为研究不同氧化还原条件下汞甲基化过程的天然实验场。

在这项发表于《Marine Life Science & Technology》的研究中，研究人员对永乐蓝洞不同深度的微生物群落进行了系统的宏基因组分析，重点关注了汞甲基化潜力。他们假设：(1)永乐蓝洞存在汞甲基化热点区域；(2)汞甲基化微生物的分布随氧化还原梯度变化；(3)微生物的生活方式（自由生活或颗粒附着）对汞甲基化有重要影响。

为了验证这些假设，研究团队在永乐蓝洞的7个深度（0、30、50、90、120、140和170米）采集了水样，并通过顺序过滤（3μm和0.22μm聚碳酸酯膜）分离了颗粒附着(PA)和自由生活(FL)微生物。随后对14个样本进行了宏基因组测序，通过两种策略进行序列组装和分箱，最终获得了223个高质量宏基因组组装基因组(MAGs)。

研究人员使用Hg-MATE数据库提供的hgcA隐马尔可夫模型谱系搜索汞甲基化基因，并通过保守基序[N(V/I)WC(A/S)(A/G)GK]进一步验证真正的HgcA序列。此外，他们还利用AlphaFold3对代表性HgcA序列进行结构预测，评估其功能潜力。

主要技术方法

本研究整合了水文化学分析与宏基因组学技术。通过尼斯科瓶采集蓝洞29个深度的水样，测定溶解氧(DO)、硫化物(H₂S)、硫酸盐(SO₄^2-)和溶解有机碳(DOC)等参数。宏基因组样本采用分级过滤分离颗粒附着(>3μm)和自由生活(0.22-3μm)微生物群落，使用改良的Zhou法提取DNA，Illumina HiSeq X-Ten平台进行测序。采用metaSPAdes和MEGAHIT进行序列组装，通过VAMB、metaBAT和MaxBin等工具分箱获取宏基因组组装基因组(MAGs)，利用Hg-MATE数据库和HMMER搜索hgcA基因，并通过AlphaFold3进行蛋白结构预测。

汞甲基化微生物的多样性

研究发现，永乐蓝洞中存在高度多样化的汞甲基化微生物群落。共鉴定出135个非冗余hgcA序列，全部属于细菌，未发现古菌来源的hgcA基因。其中超过60%的序列属于δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)，其余则分布于浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和硝化刺菌门(Nitrospinae)等类群。

系统发育分析显示，δ-变形菌纲的HgcA序列形成了三个主要分支："Delta-1"、"Delta-2"和"Delta-3"。其中Delta-3分支的进化分歧最大，分支长度最长，表明该类群可能具有独特的进化历史。浮霉菌门的HgcA序列主要与Pirellulaceae科相关，并形成一个单系群。

90%的值由节点处的黑点表示）。蓝色显示的是被分箱到MAGs中的HgcA序列，黑色显示的是从contigs预测的其他HgcA序列。使用三个一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合成酶亚基δ(CdhD)序列作为外群，以灰色显示。蓝星表示用于AlphaFold建模的代表性序列。外层圆圈用不同颜色标记HgcA序列的分类学分类。文中讨论的三个δ-变形菌纲分支（Delta-1、Delta-2和Delta-3）用橙色分支突出显示。热图显示了hgcA基因的相对丰度。比例尺表示每位点的替换数。'>

HgcA蛋白的结构特征

为了验证鉴定出的HgcA序列的功能性，研究人员选择了12个代表性序列进行AlphaFold3结构预测。所有序列均包含保守的[N(V/I)WC(A/S)(A/G)GK]基序，该基序在球状域中形成"帽螺旋"结构，含有一个严格保守的半胱氨酸残基，能够结合钴胺素（维生素B₁₂）配体中的钴，并促进甲基向汞的转移。

预测的模型显示，这些HgcA蛋白具有由五个螺旋组成的跨膜区，与先前报道的HgcA结构一致。尽管部分区域由于序列新颖性或内在无序区域而显示出相对较低的pLDDT置信度分数，但所有模型整体pTM分数均较高（≥0.73）。功能相关区域（包括球状域和跨膜片段）始终显示出较高的局部结构置信度。

特别值得注意的是，来自Hydrogenedentes的HgcA模型预测出一个额外的球状结构域，该结构域在9A0B参考结构和其他YBH HgcA模型中均不存在。这个独特的结构域位于跨膜螺旋和典型球状区域之间，由五个β-链和六个α-螺旋组成，可能作为桥接模块，调节催化核心的空间构象或可及性。

汞甲基化基因的丰度分布

研究发现，汞甲基化微生物的分布与永乐蓝洞的氧化还原梯度密切相关。在含氧的表层水体（0-70米）中，hgcA基因的比例很低。而在低氧的中间层（90米），hgcA携带微生物的比例上升至微生物群落的1.46%（FL）和1.58%（PA）。

最引人注目的是，在缺氧的深水层（120-170米）中发现了大量的hgcA基因。在120米、140米和170米深度，hgcA携带微生物估计分别占FL样品微生物群落的约30%（30.87%、28.42%和28.38%）。在PA样品中，这三个深度的相对丰度随深度增加而增加（分别为15.18%、24.26%和30.55%）。

不同生活方式的生态位分化

研究揭示了汞甲基化微生物在自由生活(FL)和颗粒附着(PA)两种生活方式下的明显生态位分化。例如，属于绿弯菌门(Chloroflexi)厌氧绳菌纲(Anaerolineae)的hgcA序列是170米深度PA样品中最丰富的hgcA基因，占微生物群落的2.36%，但在同深度FL样品中仅占0.07%。

相反，一些微生物则更倾向于自由生活方式。例如，Deltaproteobacterial MAG YBH_bin48是120米、140米和170米深度FL样品中最丰富的hgcA携带微生物，分别占微生物群落的4.31%、5.16%和3.85%，但在相应深度的PA样品中占比不超过1%，在0-90米深度几乎检测不到。

值得注意的是，虽然大多数hgcA携带微生物在深水层富集，但一些类群如硝化刺菌(Nitrospina)和粘球菌门(Myxococcota)仅在表层和中间层水体中被发现，这些类群是微氧中间层的主要汞甲基化微生物。

汞甲基化微生物的代谢潜能

对38个携带hgcA的MAGs的基因组内容分析揭示了它们多样的代谢能力。大多数MAGs在hgcA下游连续携带hgcB基因，但有六个MAGs没有连续的hgcB基因。hgcAB基因周围的基因组邻域没有发现其他与汞甲基化相关的可识别基因。

半数MAGs携带完整的细胞色素bd复合物编码基因(cydAB)，这些基因在氧化呼吸链中发挥作用。这些MAGs还包含参与其他末端氧化酶系统的部分操纵子，包括细胞色素c氧化酶、细胞色素o泛醌氧化酶和细胞色素aa3-600 menaquinol氧化酶。

研究还发现，这些MAGs中存在与氮循环和硫循环相关的基因。例如，五个属于Marinimicrobia、Myxococcales、Aminicenantes和Deltaproteobacteria的MAGs携带hao基因，编码羟胺氧化还原酶，可将NH₂OH转化为NO₂^-。而硝化刺菌门的YBH_bin180同时携带编码亚硝酸盐氧化和硝酸盐还原的基因。

此外，大多数MAGs还携带硫酸盐还原基因，包括编码异化亚硫酸盐还原酶的dsrAB、编码腺苷-5'-磷酸硫酸(APS)还原酶的aprAB以及编码ATP硫酸化酶的sat。大多数MAGs中存在亚铁和铜转运蛋白编码基因，而在浮霉菌门、拟杆菌门和Aminicenantes相关的MAGs中发现了编码Fe-Mn转运蛋白的基因。

近乎所有hgcA携带的MAGs都含有参与砷抗性系统的各种基因，包括编码亚砷酸盐甲基转移酶的arsM基因、编码砷酸盐还原酶的arsC基因、编码砷抗性转录调节因子的arsR基因以及编码负责泵出砷离子的砷泵驱动ATP酶的arsA基因。最后，在一些MAGs中发现了与鞭毛形成相关的基因，但操纵子并不完整。

研究结论与意义

本研究首次对全球最深蓝洞生态系统中的微生物汞甲基化潜力进行了详细的宏基因组表征。研究发现，永乐蓝洞深部缺氧层可能是汞甲基化的热点区域，其中δ-变形菌纲很可能主导了甲基汞的生产，凸显了汞甲基化群落组成和复杂性的独特性。

研究观察到汞甲基化微生物的分布模式变化与不同的微生物生活方式和生态位相对应，强调了沉降颗粒在促进汞甲基化过程中的关键作用。颗粒不仅在有氧环境中，而且在缺氧环境中都为汞甲基化微生物提供了适宜的微环境，扩大了其栖息地。

通过基因组内容分析，研究发现汞甲基化微生物携带多种与电子传递链、硫循环、氮循环和重金属抗性相关的基因，表明它们具有多样的代谢潜能和生态适应策略。特别是所有汞甲基化微生物都携带完整的砷抗性系统基因，提示蓝洞生态系统可能存在砷污染压力。

值得注意的是，一些汞甲基化微生物编码鞭毛组装基因，表明其具有潜在运动性。在永乐蓝洞这种氧化还原分层的水体中，运动性可能使自由生活的汞甲基化微生物能够主动寻找具有有利氧化还原条件或较高汞有效性的最佳生态位。这解释了为什么在深层缺氧FL样品中hgcA携带类群的丰度相对一致。

蛋白结构分析显示，尽管YBH来源的HgcA蛋白在球状域与参考结构高度相似，但跨膜域存在更明显的变异，这可能反映了不同类群对特定细胞膜组成的适应。Hydrogenedentes来源的HgcA模型中发现了一个额外的球状亚结构域，这可能是谱系特异性适应，调节HgcA的甲基化效率。

该研究确立了海洋蓝洞的独特性，并将其作为有价值的模型生态系统，用于推进对不同水生栖息地中微生物汞循环的理解。这些发现对于预测和管理海洋环境中的汞污染风险，保护海洋食品安全和人类健康具有重要意义。未来研究需要整合多组学分析与总汞和甲基汞浓度的同步测量，以明确建立微生物群落结构、功能基因丰度与汞甲基化过程之间的直接联系。