血管化三维生物工程肺癌模型：HIF-1α/LOX/ITGA5轴介导化疗耐药的新平台

《Cancer Cell International》：A vascularized 3D bioengineered lung tumor model for anticancer drug screening

本研究针对非小细胞肺癌(NSCLC)临床前药物筛选模型缺乏血管化微环境的关键问题，开发了一种基于人胚胎干细胞(hESCs)来源内皮细胞(ECs)、周细胞与A549细胞共培养的3D血管化肺癌模型。该模型在脱细胞肺支架(dlECM)中成功构建分层血管网络，重现低氧驱动LOX过表达、整合素介导纤维连接蛋白富集等肿瘤微环境(TME)特征，显著增强细胞迁移、MUC5AC高分泌及多药耐药性。研究证实HIF-1α/LOX信号通路通过ITGA5/FN1依赖的ECM重构驱动化疗保护作用，为个体化药物筛选提供转化价值高的生理相关平台。

　　

在精准医疗时代，非小细胞肺癌(NSCLC)仍是全球癌症相关死亡的主要原因，尽管靶向治疗和免疫检查点抑制剂取得进展，但五年生存率仍低于20%。超过70%的患者在确诊时已处于晚期，对现有治疗方案反应有限。这种治疗困境凸显了对能够真实模拟NSCLC病理生理复杂性的临床前模型的迫切需求，特别是肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用。

传统二维(2D)单层培养虽实验便捷，但无法复制天然肿瘤微环境(TME)的三维(3D)结构、细胞-基质相互作用和生化梯度。相比之下，3D培养模型能保留天然组织结构和药物反应模式，但大多数现有系统缺乏血管化这一影响肿瘤进展和治疗耐药的关键要素。血管稳态是恶性增殖和细胞死亡的核心调节因子，血管化肿瘤生长通过血管生成发生，这是一个由微环境低氧启动并通过血管内皮生长因子(VEGF)等促血管生成信号分子介导的过程。血管生成进一步导致内皮细胞分泌血小板衍生生长因子以招募周细胞，导致内皮-周细胞串扰。这种向血管期的转变是肿瘤进展的关键转折点，通过增强营养输送和废物清除实现指数级扩张。

Wang等人在《Cancer Cell International》发表的研究，通过将人胚胎干细胞(hESCs)来源的内皮细胞、周细胞与A549腺癌细胞共种子脱细胞肺支架中，建立了一种血管化3D肺癌模型。这种三培养系统成功形成了分层血管网络，重现了肿瘤微环境的关键特征，包括低氧驱动的赖氨酰氧化酶(LOX)过表达和整合素介导的纤维连接蛋白富集结缔组织增生生态位积累。

研究采用脱细胞肺支架制备与表征、hESCs定向分化、3D血管化模型构建、药物反应分析等关键技术方法，其中患者来源类器官(PDOs)来自临床肺癌样本。通过扫描电镜(SEM)、组织染色、免疫荧光、RT-qPCR、流式细胞术等技术系统评估模型特性。

制备与表征脱细胞肺支架

通过优化的洗涤剂-酶法脱细胞制备肺支架，扫描电镜显示dlECM支架完全消除细胞但保留肺泡结构。韦格特染色显示支架保留大量弹性纤维，阿辛蓝染色证实保留大量黏蛋白、蛋白聚糖和透明质酸。免疫荧光显示胶原蛋白I分布与天然组织相当，DNA去除率>97%，硫酸化糖胺聚糖(sGAG)含量略有降低但不显著。

3D血管化支架中的细胞生物相容性、增殖和扩展

流式细胞术证实hESCs成功分化为CD31⁺内皮细胞和PDGFRβ⁺周细胞。三培养系统在dlECM支架中建立，活/死细胞染色显示高活细胞比例，DNA含量14天内增加21.9倍。免疫荧光显示CD31⁺内皮细胞形成血管样结构并能摄取Dil-AcLDL。

血管化3D微环境促进细胞迁移和黏蛋白5AC表达

Transwell分析显示细胞迁移能力顺序为：3D共培养>3D单培养>2D共培养>2D单培养。免疫荧光和RT-qPCR证实3D共培养组MUC5AC表达显著升高，表明血管化3D模型显著促进A549细胞迁移和黏液分泌能力。

3D预血管化模型增加多药耐药性

血管化3D模型表现出增强的化疗耐药性。顺铂(10μg/mL)处理48小时后，细胞凋亡率随模型复杂性增加而降低：2D单培养(56.9±3.2%)>2D共培养>3D单培养(31.9±1.9%)>3D共培养(14.7±1.1%)。吉西他滨和紫杉醇也显示类似趋势。流式细胞术进一步证实3D共培养模型的耐药特征。

血管化3D模型展示增强的化疗耐药性

预血管化系统通过三种相互关联的机制发展显著化疗耐药性。RT-qPCR显示3D共培养组ABC转运蛋白基因LRP、MDR1和MRP1表达高于2D单培养组，其中MDR1表达是对照组的7.74±0.45倍。代谢分析显示dlECM支架诱导Warburg样代谢重编程，葡萄糖消耗和乳酸产生增加4倍以上。活性氧(ROS)积累与HIF-1α表达增加相关。免疫荧光共染色证实耐药蛋白上调主要集中于3D共培养组的A549细胞群。

化疗耐药由低氧介导的ECM重构驱动

为阐明低氧介导的化疗耐药机制，研究系统分析了HIF-1α信号和下游ECM重构的动态变化。RT-qPCR显示3D dlECM培养物中HIF-1α mRNA表达水平比2D对照增加2.4倍。免疫荧光证实3D共培养组68.2±5.1%细胞核显示HIF-1α聚集。LOX(比2D共培养高4.3±0.4倍)及其ECM重构靶点ITGA5(1.9±0.3倍)和FN1(3.3±0.5倍)在3D共培养中同时上调。低氧介导的HIF-1α、LOX和ITGA5上调导致纤维连接蛋白组装增加，从而阻碍药物渗透。

dlECM中肺腺癌患者来源类器官

为验证预血管化3D生物工程模型的临床相关性，建立肺腺癌患者来源类器官(PDOs)模拟体内肿瘤特征。H&E染色显示PDOs维持腺泡结构，免疫组化证实肺腺癌生物标志物甲状腺转录因子1(TTF-1)、天冬氨酸肽酶(Napsin A)和细胞角蛋白7(CK7)在PDOs和原发肿瘤组织中表达一致。Ki67反映NSCLC快速增殖的临床特征。PDOs整合到预血管化dlECM平台生成类器官来源三维细胞培养(3DCC)模型，顺铂、吉西他滨和紫杉醇显示剂量依赖性细胞毒性，IC₅₀值分别为17.10μg/mL、56.99μg/mL和33.14μg/mL。Annexin V/PI凋亡 assay显示晚期凋亡细胞优先积累在dlECM外围，表明药物通过ECM密集TME区域渗透有限。

该研究建立的3D共培养肺癌模型通过A549腺癌细胞与H9来源内皮细胞和周细胞的系统共培养，实现了dlECM内肿瘤-血管动态的时空表征。该模型的特殊性在于详细模拟肿瘤发展及周围微环境，从血管网络组装开始，随后是肿瘤驱动的血管生成，从而反映天然TME中观察到的相互细胞串扰。该平台支持从患者组织来源的肿瘤类器官衍生，保留肿瘤-基质相互作用，为疾病进展提供机制见解，同时推进个性化药物筛选范式。

值得注意的是，基于dlECM的3D培养物对顺铂、吉西他滨和紫杉醇的耐药性显著高于2D培养物，显示其临床预测价值。dlECM生物结构支持衍生患者组织来源的肿瘤类器官，保留肿瘤-基质相互作用，为疾病进展提供机制见解，同时推进个性化药物筛选范式。尽管该血管化肿瘤模型显示出有前景的临床前效用，但仍存在关键局限性，特别是缺乏能够模拟药物输送和免疫细胞介导的微环境串扰的功能性血管灌注。基于现有血管化模型的可灌注模型将是下一步研究的重点。