靶向Claudin-6的双步递送系统：增强实体瘤药物递送效率与安全性的从头设计

《Journal of Translational Medicine》：De novo design of a two-step approach targeting Claudin-6 for enhanced drug delivery to solid tumors

本研究针对抗体偶联药物(ADC)在实体瘤治疗中肿瘤蓄积不足和脱靶毒性等挑战，开发了一种靶向Claudin-6(CLDN6)的双步递送系统。研究人员通过噬菌体展示技术筛选出高亲和力抗CLDN6锚定重复蛋白(DARPins)，并基于SpyTag/SpyCatcher分子对构建了双步递送系统DST/SCC。该系统在体外、离体和体内实验中均显示出优异的肿瘤靶向性，能显著提高细胞毒性药物MMAE在CLDN6+肿瘤中的富集，并有效抑制肿瘤生长。该研究为增强肿瘤靶向治疗疗效、降低副作用提供了新策略。

　　

在癌症治疗领域，抗体偶联药物(ADC)如同一把精准的"生物导弹"，通过抗体将细胞毒性药物定向输送至肿瘤细胞。然而，这颗"导弹"在实战中仍面临两大难题：一是难以穿透实体瘤深部，导致药物在肿瘤核心区域分布不足；二是循环过程中在正常组织非特异性蓄积，引发脱靶毒性。这些局限性促使科学家不断探索更智能的药物递送策略。

传统ADC药物通常采用抗体作为靶向头，但其大分子量犹如"巨轮入港"，在肿瘤组织渗透中遇到阻碍。与此同时，科学家们发现一种名为Claudin-6(CLDN6)的蛋白在胚胎发育期活跃表达，在成人正常组织中却保持沉默，而在多种实体瘤中重新激活。这种"只在癌细胞露面"的特性使CLDN6成为理想的靶点。南京大学鼓楼医院Yan等人在《Journal of Translational Medicine》发表的研究，正是基于这一发现，设计了一种创新的双步递送系统，为突破现有ADC药物的局限提供了新思路。

研究人员开展的本项研究主要采用了以下几个关键技术方法：通过生物信息学分析评估CLDN6在泛癌数据集中的表达模式；利用噬菌体展示技术筛选并优化抗CLDN6 DARPins；基于SpyTag/SpyCatcher分子对构建双步递送系统，其中靶向剂(DST)由DARPins融合SpyTag构成，效应剂(SCC)由SpyCatcher融合K5自组装肽和半胱氨酸构成；通过免疫荧光染色、流式细胞术和活体成像评估系统的靶向能力和生物分布；将MMAE与SCC偶联后，通过细胞活力实验和动物模型评估抗肿瘤效果和安全性。研究中涉及的人类组织样本来自南京鼓楼医院病理科。

Identification of CLDN6 as a potential therapeutic target

通过分析泛癌数据集发现，CLDN6在25种实体瘤中的表达显著高于正常组织，其中卵巢癌表达量提升15倍。CLDN6表达与肿瘤干细胞特性呈正相关，且会降低B细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞等免疫细胞浸润。这些结果表明CLDN6是具有潜力的治疗靶点。

Correlation of CLDN6 with clinical prognosis in GC and OV patients

免疫组化证实CLDN6蛋白在胃癌和卵巢癌组织细胞膜上特异性表达，而在成人正常器官中缺失。生存分析显示，CLDN6高表达与卵巢癌和胃癌患者较差的总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)等预后指标相关。

Characterization of anti-CLDN6 DARPins with high affinity

通过四轮噬菌体展示淘选获得抗CLDN6 DARPins(C6DP)，纯度超过95%。结合实验显示C6DP能特异性结合CLDN6⁺的AGS细胞，相对亲和力达7.98×10^-9 M。内化实验表明C6DP在4小时和8小时与溶酶体标志物LAMP1共定位，显示其被细胞内化。

Detection of Claudin-6 with DARPins ex vivo

在临床样本中，C6DP能特异性识别CLDN6⁺的卵巢癌和胃癌组织，而在正常成人组织(如食管、胃、肠道等)中几乎无信号，表明C6DP与其他紧密连接蛋白交叉反应性低。

DARPins-fused two-step delivery system targeting Claudin-6 in vitro

成功构建双步递送系统DST/SCC，其中SCC包含K5自组装肽和4个半胱氨酸(优化DAR=4)。体外实验显示，C6DP融合的双步系统能特异性将Cy5递送至CLDN6⁺的AGS和HepG-2细胞，而对正常细胞系(NCM460、GES-1等)递送效率低。

DST/SCC targeting Claudin-6 ex vivo and in vivo

离体实验表明C6DP-DST/SCC能特异性将Cy5递送至CLDN6⁺胃癌组织。在荷瘤小鼠体内，双步给药组(DST后3小时给予SCC-Cy5)在AGS肿瘤中表现出更高的信噪比(SNR)和更长的半衰期，且载荷更多分布于肿瘤核心而非血管周围区域。

DST/SCC-conjugated MMAE efficiently killed CLDN6⁺ cancer cells in vitro

SCC与Vc-MMAE成功偶联得到SCC-MMAE。细胞活力实验显示，双步给药(DST后给予SCC-MMAE)对AGS细胞的IC₅₀为7.5 nM，优于一步法(12.6 nM)和游离MMAE(8.2 nM)。三维肿瘤球体实验也证实双步系统能有效抑制CLDN6⁺肿瘤球体生长。

Enhanced therapeutic potency of DST/SCC-conjugated MMAE in vivo

在AGS荷瘤小鼠模型中，双步治疗组(MMAE当量剂量)肿瘤生长抑制效果显著优于一步组和游离MMAE组，且重要器官未发现明显病理改变。血液学指标和肝肾功能检测未见显著差异，红细胞溶血实验显示DST和SCC蛋白无溶血毒性。

本研究证实CLDN6是实体瘤治疗的理想靶点，基于抗CLDN6 DARPins和SpyTag/SpyCatcher分子对构建的双步递送系统DST/SCC，能实现细胞毒性药物的高效肿瘤靶向递送。该系统通过预靶向策略改善药物动力学分布，提高信噪比，增强肿瘤穿透性，从而在降低副作用的同时提升抗肿瘤疗效。该研究为克服传统ADC药物的局限性提供了新思路，为开发更安全有效的肿瘤靶向疗法奠定了坚实基础。未来可探索将该策略应用于免疫细胞疗法等更广泛领域，进一步拓展其临床应用前景。