AFAP1-AS1通过促进SRSF1/SRSF3相分离调控AXIN2可变剪接诱导肺腺癌耐药的新机制

《Molecular Cancer》：Long non-coding RNA AFAP1-AS1 promotes alternative splicing of AXIN2 by facilitating SRSFs phase separation to induce drug resistance in lung adenocarcinoma

本研究针对肺腺癌化疗和靶向治疗耐药这一临床难题，揭示了长链非编码RNA AFAP1-AS1通过促进剪接因子SRSF1和SRSF3的液-液相分离，调控关键基因AXIN2第7外显子跳跃，产生截短型AXIN2-S异构体，进而激活Wnt/β-catenin信号通路，最终诱导耐药的新机制。该发现为肺腺癌耐药提供了新的生物标志物和潜在治疗靶点。

　　

肺癌是目前全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中肺腺癌是最常见且最具侵袭性的亚型。尽管化疗和靶向治疗是肺腺癌的标准治疗方案，但肿瘤耐药性仍然是临床上面临的重大挑战。长链非编码RNA（lncRNA）作为一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，在维持正常生物学功能以及多种疾病的发生发展中起着至关重要的作用。其中，AFAP1-AS1作为一种在多种恶性肿瘤中高表达的致癌lncRNA，其具体作用机制尚未完全阐明，尤其是在RNA可变剪接调控方面的功能仍有待探索。

在这项发表于《Molecular Cancer》的研究中，Ouyang等人深入探讨了AFAP1-AS1在肺腺癌耐药中的作用机制。研究人员发现，AFAP1-AS1能够直接与剪接因子SRSF1和SRSF3结合，并促进它们的液-液相分离，从而广泛调控肺腺癌细胞中的RNA可变剪接事件。在众多受影响的剪接事件中，Wnt/β-catenin信号通路关键调控基因AXIN2的第7外显子跳跃最为显著，导致产生截短的AXIN2-S异构体。这种异构体通过抑制β-catenin的降解，促进其核积聚，持续激活Wnt/β-catenin信号通路，最终导致肺腺癌的化疗和靶向治疗耐药。

为开展此项研究，作者团队运用了RNA pulldown联合质谱分析、RNA免疫共沉淀（RIP）、荧光原位杂交与免疫荧光共定位、荧光漂白恢复（FRAP）技术、RNA-seq转录组测序与可变剪接分析（rMATS）、minigene报告系统、蛋白质印迹、核质分离、细胞活力与克隆形成实验、以及小鼠皮下移植瘤模型等关键技术方法。临床样本来源于中南大学湘雅医院收治的接受卡铂-紫杉醇联合治疗（38例）或奥希替尼治疗（63例）的肺腺癌患者组织。

AFAP1-AS1直接与SRSF1和SRSF3结合

研究人员通过RNA pulldown联合质谱分析发现AFAP1-AS1可与多种RNA剪接相关蛋白结合，并进一步通过重复的RNA pulldown、RIP以及荧光共定位实验证实了AFAP1-AS1与剪接因子SRSF1和SRSF3之间存在直接相互作用。

利用catRAPID工具预测并结合截短体RNA pulldown实验，确定了AFAP1-AS1上与SRSF1和SRSF3结合的关键区域。同时，发现SRSF1的RRM1和RRM2结构域以及SRSF3的RRM结构域对其与AFAP1-AS1的结合至关重要。

AFAP1-AS1调控肺腺癌中的可变剪接事件

通过在肺腺癌A549细胞中过表达和敲低AFAP1-AS1并进行RNA-seq分析，研究人员发现AFAP1-AS1调控了数千个可变剪接事件，主要涉及外显子跳跃（SE）、内含子保留（RI）等五种类型。整合分析后共鉴定出2086个共同受调控的剪接事件。

其中，AXIN2、SP140L、SMC5和KIF13A等基因的剪接事件受到显著调控，尤其是AXIN2第7外显子的跳跃。RT-PCR实验证实AFAP1-AS1过表达增加AXIN2-S（短异构体）mRNA的产生，敲低AFAP1-AS1则增加AXIN2-L（长异构体）mRNA的水平。

AFAP1-AS1促进SRSF1和SRSF3的相分离

Co-IP实验证实SRSF1和SRSF3可相互结合，且AFAP1-AS1可增强二者的结合亲和力。免疫荧光显示SRSF1和SRSF3在细胞核内呈点状凝聚物分布，具有相分离特征。使用相分离抑制剂1,6-己二醇（1,6-hex）处理可破坏这些凝聚物。

过表达AFAP1-AS1可增加SRSF1和SRSF3 punctate凝聚物的形成，而敲低AFAP1-AS1则减少其形成。FRAP实验进一步表明，AFAP1-AS1过表达加速了SRSF1和SRSF3凝聚物的荧光恢复速率，证实AFAP1-AS1通过促进SRSF1和SRSF3的相分离来发挥功能。

AFAP1-AS1通过促进SRSF1和SRSF3相分离调控AXIN2的可变剪接

以AXIN2第7外显子跳跃为模型，研究发现敲低SRSF1或SRSF3均可抑制该剪接事件，且能逆转AFAP1-AS1过表达所诱导的剪接效应。1,6-己二醇处理同样能抑制AFAP1-AS1过表达对AXIN2外显子跳跃的促进作用。

通过RBPmap数据库预测并结合RIP实验验证了SRSF1和SRSF3在AXIN2前体mRNA内含子6和7区域的结合位点。利用AXIN2 minigene报告系统进一步证实AFAP1-AS1、SRSF1和SRSF3均能直接促进外源性AXIN2第7外显子的跳跃。

AFAP1-AS1通过促进AXIN2-S表达激活Wnt/β-catenin通路

构建AXIN2-L和AXIN2-S的真核表达载体后，蛋白质印迹分析显示AXIN2-S能增强β-catenin表达，抑制其磷酸化和泛素化降解，促进其核积聚，从而激活Wnt/β-catenin通路；而AXIN2-L则作用相反。

AFAP1-AS1的过表达或敲低对β-catenin的表达、磷酸化、降解及核质分布具有相应的调控作用。在敲低AFAP1-AS1的同时过表达AXIN2-S可部分挽救β-catenin表达的下降，而过表达AXIN2-L则无此效果。此外，AXIN2-S也能部分挽救AFAP1-AS1敲低导致的N-cadherin和Vimentin表达下降，提示该剪接调控事件与上皮-间质转化（EMT）相关。

AFAP1-AS1通过上调AXIN2-S促进肺腺癌耐药

细胞功能实验表明，过表达AFAP1-AS1能增强A549和PC9细胞对卡铂、紫杉醇以及PC9细胞对奥希替尼的耐药性，而敲低AFAP1-AS1则增加细胞对药物的敏感性。过表达AXIN2-S能模拟AFAP1-AS1的促耐药作用，且在AFAP1-AS1敲低背景下过表达AXIN2-S可逆转其增敏效应。

在PC9奥希替尼耐药细胞（PC9-OR）中，AFAP1-AS1过表达可进一步增强耐药，而其敲低则可部分恢复细胞对奥希替尼的敏感性。

AFAP1-AS1促进肺腺癌耐药的体内实验和临床样本证据

小鼠皮下移植瘤模型实验显示，在化疗（卡铂+紫杉醇）或靶向治疗（奥希替尼）条件下，敲低AFAP1-AS1能显著抑制肿瘤生长。

对101例临床肺腺癌组织样本的分析表明，AFAP1-AS1低表达的患者对治疗的反应更好，且AFAP1-AS1表达与β-catenin表达呈正相关。

研究结论与意义

本研究首次揭示了AFAP1-AS1通过调控剪接因子相分离来影响RNA可变剪接的新功能，并阐明了其通过诱导AXIN2第7外显子跳跃产生AXIN2-S异构体，进而激活Wnt/β-catenin通路促进肺腺癌耐药的完整分子机制。该研究不仅深化了对lncRNA功能多样性的认识，拓展了AFAP1-AS1在癌症生物学中的作用范围，更重要的是为理解肺腺癌耐药机制提供了新的视角。AFAP1-AS1及其调控的剪接事件有望成为肺腺癌诊断、预后判断和克服耐药的新靶点，具有重要的理论意义和潜在的临床转化价值。