基于MerTK嵌合抗原受体工程化星形胶质细胞清除α-突触核蛋白寡聚体治疗帕金森病的实验研究

《Translational Neurodegeneration》：Attenuating α-synuclein pathology in mice with in situ engineered astrocytes

本研究针对帕金森病（PD）中α-突触核蛋白寡聚体（α-synOs）介导的神经毒性及神经炎症等关键病理环节，创新性地构建了靶向α-synOs的嵌合抗原受体（CAR），并将其特异性表达于星形胶质细胞（CAR-A）。该CAR以MerTK受体为骨架，将其配体结合域替换为特异性识别α-synOs的单链可变片段（scFv）3A。研究证实，CAR-A能有效吞噬α-synOs，并通过激活Rac1、Cdc42和RhoA信号通路增强吞噬活性，同时通过抑制NF-κB等通路显著减少促炎细胞因子释放。在A53T转基因PD模型小鼠中，原位CAR-A治疗能有效清除α-synOs，改善多巴胺能神经元存活，减轻神经炎症，并显著改善小鼠的运动和认知功能缺陷。该研究为PD及其他神经退行性疾病的治疗提供了一种具有潜力的细胞工程新策略。

　　

在大脑这个精密的指挥中心里，神经元固然是耀眼的明星，但占细胞数量近半的星形胶质细胞（Astrocyte）则是默默无闻的“后勤部长”，负责维持大脑内环境的稳定，包括清除代谢废物。然而，在帕金森病（Parkinson's disease, PD）等神经退行性疾病中，一种名为α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）的蛋白质会发生错误折叠并聚集，形成尤其具有毒性的寡聚体（α-syn oligomers, α-synOs）。这些α-synOs不仅直接损害神经元，还会“策反”星形胶质细胞，使其从维护者转变为破坏者——功能失调，并释放大量炎症因子，加剧脑内炎症风暴，最终导致制造多巴胺的关键细胞（多巴胺能神经元）死亡，患者出现震颤、僵硬、运动迟缓等症状。如何精准清除这些“毒蛋白”同时平息脑内的“炎症风暴”，是当前PD治疗面临的重大挑战。

针对这一难题，发表在《Translational Neurodegeneration》上的研究报道了一项创新性疗法。研究人员巧妙地对星形胶质细胞进行“基因改造”，为其装备上一种名为“嵌合抗原受体”（Chimeric Antigen Receptor, CAR）的“智能武器”。这把“武器”的瞄准镜是一个能特异性识别并结合α-synOs（而非单体或纤维）的单链抗体片段（single-chain variable fragment, scFv）3A，而“扳机”和“安全锁”则采用了主要表达于具有抗炎特性细胞上的MerTK受体（Mer tyrosine kinase）的关键部分。当这种CAR与α-synOs结合后，既能启动细胞的“吞噬”程序清除毒蛋白，又能发出“抗炎”信号，避免伤及无辜。这种经过工程化改造的星形胶质细胞被称为CAR-A。

为验证CAR-A的效果，研究团队主要运用了分子生物学技术构建CAR表达载体，通过细胞模型（原代星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元）评估其体外功能，并利用A53T转基因PD模型小鼠（通过脑内注射α-syn预形成纤维体（preformed fibrils, PFFs）加速病理）进行在体治疗实验。行为学测试（包括杆测试、悬线测试、Y迷宫、旷场实验等）用于评估小鼠运动及认知功能改善情况。此外，还综合运用了蛋白质印迹（Western blot）、免疫组织化学/免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术、GST pull-down、RNA测序（RNA-seq）等多种技术手段从分子、细胞及整体动物水平深入探究其作用机制。

CAR在星形胶质细胞上的表达

研究人员成功构建了CAR表达质粒，其核心是将MerTK受体的配体结合域（第19-275位氨基酸）替换为特异性靶向α-synOs的scFv 3A，并置于星形胶质细胞特异性启动子GfaABC1D的控制之下，同时融合表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）以便追踪。

实验证实，CAR能完整地表达在星形胶质细胞膜上，且主要存在于具有神经保护特性的A2型星形胶质细胞中，而在神经元或小胶质细胞中未见表达。

CAR-A对α-synOs的吞噬和降解

研究发现，CAR-A能高效、特异地结合并吞噬α-synOs，而对α-syn单体无此作用。

这一过程可分为结合、吞噬、消化（通过溶酶体途径）和恢复四个阶段。与表达非特异性CAR（ns-CAR-A）或空载体（NC-A）的对照组相比，CAR-A细胞内α-synOs的水平随时间显著下降，表明其具有强大的清除能力。

CAR-A的吞噬机制和抗炎作用

机制研究表明，α-synOs与CAR结合后，能引起CAR二聚化并发生磷酸化，进而激活下游的Rho家族GTP酶（Rac1、Cdc42和RhoA），这些分子是调控细胞骨架重排和吞噬作用的关键开关。

与此同时，CAR的激活显著抑制了由α-synOs通常所引发的NF-κB通路活化（表现为IκB-α降解减少和p65磷酸化水平降低），并上调了细胞因子信号抑制因子（SOCS1/3）的表达。

其结果是，CAR-A在处理α-synOs后，释放的促炎细胞因子（如TNF-α, IL-6）显著减少，而抗炎细胞因子（如IL-4, TGF-β）得以维持。

更重要的是，来自CAR-A的条件培养基不会诱导小胶质细胞产生炎症反应，也能保护神经元免受α-synOs的毒性损害，减少细胞凋亡。

CAR-A保留星形胶质细胞的主要生物学功能

RNA测序分析显示，CAR的表达并未显著影响星形胶质细胞维持基本功能（如谷氨酸代谢、离子平衡、突触支持等）相关基因的表达，但下调了与补体和凝血级联反应相关的一些基因，这可能有助于减轻神经炎症。这表明CAR-A在获得新功能的同时，其正常的生理功能得以保留。

CAR-A减轻A53T小鼠模型的行为学缺陷

在PD模型小鼠（PFFs加速的A53T转基因小鼠）中，通过立体定位注射将表达CAR的腺相关病毒（AAV）递送至小鼠脑内特定区域（体感皮层和背侧新纹状体），可实现CAR在星形胶质细胞上的原位表达。行为学测试表明，与接受PBS或ns-CAR治疗的模型鼠相比，CAR治疗显著改善了小鼠的运动协调性（在杆测试和悬线测试中表现更佳）和认知功能（在Y迷宫和旷场实验中表现出更好的空间记忆和更少的焦虑样行为）。

CAR-A降低A53T小鼠脑内α-syn聚集水平

组织学分析证实，CAR-A在体同样能有效吞噬α-synOs。与对照组相比，CAR治疗组小鼠脑干和皮层中能被3A识别的α-synOs水平、总α-syn水平（尤其在Triton X-100不溶性组分中）以及病理性的磷酸化α-syn（pS129 α-syn）水平均显著降低。

同时，CAR在存在α-synOs的A53T小鼠脑中能被有效激活（磷酸化水平升高），而在野生型小鼠脑中激活不明显。

CAR-A提高PD小鼠模型中的TH水平和神经递质

CAR治疗显著减轻了A53T小鼠黑质（Substantia Nigra, SN）区多巴胺能神经元（酪氨酸羟化酶TH阳性细胞）的丢失和凋亡，并增加了纹状体内TH神经纤维的密度。

相应地，纹状体内多巴胺（DA）及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）的水平也得到显著恢复。

CAR-A减轻PD小鼠模型的神经炎症

CAR治疗还显著抑制了模型鼠脑内的神经炎症反应，表现为黑质和纹状体区域的小胶质细胞和星形胶质细胞活化（分别为Iba-1和GFAP阳性信号）减轻，反应性星形胶质细胞标志物C3表达下降，促炎细胞因子（如IFN-γ, IL-1β, iNOS）水平降低，而抗炎细胞因子（如IL-4, TGF-β）水平升高。

这表明CAR-A有效改善了脑内微环境。

结论与讨论

本研究成功开发了一种基于MerTK的抗炎型CAR，能引导星形胶质细胞特异性识别并清除帕金森病中的关键致病因子α-synOs，同时抑制神经炎症反应。这种“一石二鸟”的策略在细胞和动物模型中均展现出显著的治疗效果。与传统的抗体疗法相比，这种原位细胞工程方法具有靶向性强、可局部长期表达、且能根据病理刺激动态调节活性的潜在优势。该研究不仅为帕金森病的治疗提供了新的思路，其CAR平台技术通过更换不同的scFv，理论上也可应用于清除其他神经退行性疾病中的致病蛋白聚集物（如Aβ, tau等），展现出广阔的应用前景。当然，将此项技术推向临床仍面临挑战，如载体递送效率、长期安全性及免疫原性等，但无疑，这项研究为开发下一代神经退行性疾病疗法开辟了一条富有创新性的路径。