靶向CD8+T细胞纳米载药系统递送铁死亡抑制剂Fer-1通过调控PI3K/Akt和MAPK通路缓解急性肺损伤

《Journal of Nanobiotechnology》：Inhalable targeted CD8?+?T cell nanoparticles loaded ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 alleviate acute lung injury

本研究针对脓毒症诱发的急性肺损伤（ALI）中CD8+T细胞铁死亡关键机制，构建了CD8单抗修饰的PD-1工程化细胞膜包载PLGA/Fer-1的仿生纳米粒（CD8@PD-1-CTL-M@PLGA/Fer-1）。结果表明，该纳米系统可精准靶向肺组织CD8+T细胞，通过抑制ACSL4、上调GPX4表达，并调控PI3K/Akt和MAPK信号通路，显著改善线粒体功能，减轻ALI病理损伤。该研究为ALI的靶向治疗提供了新策略。

　　

当机体遭遇严重感染引发脓毒症时，急性肺损伤（ALI）是其常见且危重的并发症，可进一步发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS），病死率高。在ALI复杂的发病机制中，除了炎症因子风暴，氧化应激产物的积累及免疫细胞功能紊乱日益受到关注。近年来研究表明，铁死亡（ferroptosis）——一种铁依赖性的脂质过氧化驱动的新型细胞死亡方式，在ALI的发生发展中扮演重要角色。特别值得注意的是，作为免疫应答关键效应细胞的CD8⁺T细胞（细胞毒性T淋巴细胞，CTL）在ALI环境中会发生铁死亡，其功能受损可能加剧肺组织损伤。另一方面，免疫检查点分子PD-1在耗竭性T细胞表面高表达，与CD8⁺T细胞功能抑制密切相关。能否靶向这些功能异常的CD8⁺T细胞，精准干预其铁死亡过程，从而缓解ALI？这成为了一个极具潜力的治疗新思路。

传统的铁死亡抑制剂如Ferrostatin-1（Fer-1）虽有效，但存在靶向性差、生物利用度低等问题。纳米技术的发展为药物递送提供了解决方案，其中，仿细胞膜纳米载体因其良好的生物相容性和主动靶向能力备受青睐。发表在《Journal of Nanobiotechnology》上的这项研究，旨在构建一种新型吸入式靶向纳米系统，用于将Fer-1特异性递送至ALI病灶区的CD8⁺T细胞，以期实现高效低毒的治疗效果。

研究人员首先通过单细胞测序等技术确认了ALI小鼠肺组织中CD8⁺T细胞确实存在铁死亡，且其表面PD-1表达上调。这为后续设计以PD-1为靶点的仿生载体提供了理论依据。核心技术创新在于：从高表达PD-1的CD8⁺T细胞（通过慢病毒转染构建）中提取细胞膜（PD-1-CTL-M），再用CD8单克隆抗体对其进行修饰，形成CD8@PD-1-CTL-M。然后将此功能化细胞膜包裹在装载有Fer-1的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒外层，最终成功制备出仿生纳米颗粒CD8@PD-1-CTL-M@PLGA/Fer-1（简称CPPF）。

为开展研究，作者团队运用了多项关键技术方法：通过磁珠分选从小鼠脾脏分离高纯度CD8⁺T细胞；利用慢病毒载体构建PD-1过表达的CTL模型；采用超声破碎结合差速离心法提取细胞膜；通过EDC/NHS催化偶联反应将CD8单抗修饰到细胞膜上；采用纳米沉淀法制备PLGA/Fer-1核心，并通过挤出法实现细胞膜的包覆；利用纳米粒度电位仪、透射电镜、SDS-PAGE、红外光谱等对纳米粒的理化性质进行表征；通过小动物活体成像技术评估纳米粒的体内分布与靶向性；建立LPS诱导的小鼠ALI模型和体外LPS刺激的CD8⁺T细胞模型进行药效学评价；采用RNA测序进行机制初探，并通过Western blot、免疫荧光、试剂盒检测等手段验证相关信号通路（PI3K/Akt, MAPK）及铁死亡指标；使用分子对接模拟Fer-1与潜在靶点的相互作用；通过检测血清生化指标和组织病理学切片进行体内安全性评价；并进行了药代动力学研究。

结果

CD8⁺T细胞在ALI小鼠肺组织中减少并发生铁死亡

研究发现，LPS诱导的ALI小鼠肺组织出现铁超载。单细胞测序结果显示，铁死亡标志基因ACSL4的表达主要在CD8⁺T细胞（CTL）中升高。同时，LPS刺激的CD8⁺T细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）水平显著降低，而4-羟基壬烯醛（4-HNE）、丙二醛（MDA）、Fe²⁺水平显著升高，铁死亡关键蛋白GPX4、SLC7A11和铁蛋白轻链（FTL）表达下降。这些证据表明CD8⁺T细胞在ALI中发生了铁死亡。此外，免疫荧光证实CD8⁺T细胞表面PD-1蛋白表达增加，而CD8阳性细胞数量随时间推移逐渐减少，为靶向治疗提供了基础。

CD8@PD-1-CTL-M@PLGA/Fer-1的构建与鉴定

研究成功构建了PD-1过表达的CTL（PD-1-CTL），并从中提取了细胞膜（PD-1-CTL-M）。经CD8单抗修饰后，形成的CD8@PD-1-CTL-M（CPP）与PLGA/Fer-1（PF）通过一锅法合成CPPF纳米粒。表征结果显示，CPPF呈杯状脂质双层结构，粒径约110-120 nm，载药量和包封率分别为47.75±4.62%和82.62±5.46%。SDS-PAGE证实纳米粒继承了源细胞膜的蛋白成分。共聚焦显微镜观察显示PD-1与CD8在膜上具有良好的共定位。

CD8@PD-1-CTL-M@PLGA/Fer-1对CD8⁺T（CTL）和肺组织的靶向性

细胞摄取实验表明，CPPF/DiR在CTL中显示出最强的荧光强度，表明其具有最高的细胞摄取效率。小动物活体成像显示，CPPF/cyc5.5在肺组织的荧光强度显著高于PLGA/Fer-1/cyc5.5和PD-1-CTL-M@PLGA/Fer-1/cyc5.5，证明CD8抗体修饰增强了纳米粒对肺组织及其中CD8⁺T细胞的靶向能力。纳米粒主要经肝脏代谢和肾脏排泄。

CD8@PD-1-CTL-M@PLGA/Fer-1治疗ALI的作用及机制探索

RNA测序分析提示，CPPF治疗ALI的潜在机制与PI3K-Akt和MAPK信号通路密切相关。在LPS诱导的ALI小鼠模型中，吸入CPPF纳米粒能显著减轻肺组织湿干重比（w/d）和髓过氧化物酶（MPO）活性，改善肺组织病理损伤，降低吸气阻力（RL）和呼气阻力（Re），提高肺动态顺应性（Cdyn）和每分钟最大通气量（MV）。同时，CPPF处理提升了SOD活性，降低了MDA、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。Western blot和免疫荧光结果显示，CPPF能显著上调GPX4蛋白表达，下调ACSL4、磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化Akt（p-Akt）和磷酸化P38 MAPK（p-P38 MAPK）的表达。电镜观察发现CPPF改善了LPS引起的线粒体收缩变圆等形态异常。

在体外LPS刺激的CD8⁺T细胞模型中，CPPF同样表现出良好的保护作用：降低活性氧（ROS）、MDA、GSH-px、4-HNE、Fe²⁺及炎症因子水平，提高SOD和GSH水平。分子对接表明Fer-1与PI3K和P38MAPK有较好的亲和力。机制上，CPPF抑制了p-PI3K, p-Akt和p-P38 MAPK的活化，并改善了线粒体功能，包括提高线粒体耗氧率（OCR）、ATP含量和线粒体膜电位（MMP）。使用PI3K抑制剂LY294002和p38MAPK抑制剂SB203580可逆转CPPF的保护作用，进一步证实了这两条通路的关键角色。

CD8@PD-1-CTL-M@PLGA/Fer-1的体内安全性评价和药代动力学评估

安全性实验显示，不同剂量CPPF（1.25, 2.5, 5 mg/kg）吸入给药对小鼠的肝功能（ALT, AST, TBIL, ALB）、肾功能（Cr, BUN）、心肌酶谱（CK, LDH）均无显著影响，主要脏器未见明显病理损伤。药代动力学研究表明，CPPF纳米粒能显著提高Fer-1的生物利用度，延长其在体内的滞留时间，并具有缓释特性。纳米粒在4℃下储存60天，粒径和Zeta电位保持稳定。

结论与讨论

本研究成功构建了一种吸入式、靶向CD8⁺T细胞的仿生纳米递药系统CPPF。该研究首次将PD-1工程化的CD8⁺T细胞膜与CD8单抗修饰策略相结合，用于递送铁死亡抑制剂Fer-1，实现了对ALI病灶区特定免疫细胞的精准干预。结果表明，CPPF能高效靶向肺组织CD8⁺T细胞，通过抑制PI3K/Akt和MAPK信号通路，有效拮抗铁死亡，改善线粒体功能，从而减轻脓毒症引起的急性肺损伤。该纳米系统还解决了Fer-1靶向性差和生物利用度低的问题，且显示出良好的安全性。

这项研究的意义在于：一方面，深化了对ALI发病机制中免疫细胞铁死亡作用的认识；另一方面，为ALI及其他免疫相关疾病的靶向治疗提供了新的思路和技术平台。这种基于自身细胞膜的仿生策略具有高度的生物相容性和个性化治疗潜力。未来，该技术平台有望应用于其他疾病模型的治疗探索，具有广阔的转化前景。