神经介素B通过NMBR-钙稳态-MAMs轴调控山羊颗粒细胞增殖的新机制

《Journal of Ovarian Research》：Neuromedin B drives goat granulosa cell proliferation via NMBR-mediated calcium homeostasis

本研究针对神经介素B(NMB)在卵巢 follicular 发育中的具体调控机制尚不明确的问题，通过系统解析NMB与其受体NMBR介导的钙离子(Ca2+)稳态、内质网-线粒体结构偶联(MAMs)及线粒体代谢重编程对山羊颗粒细胞(GCs)增殖的级联调控作用，揭示了NMB/NMBR信号通过“Ca2+ homeostasis-MAMs-mitochondrial metabolism”轴促进 follicular 发育的新机制，为改善山羊繁殖效率提供了理论突破。

　　

在雌性生殖系统中，卵巢作为核心器官，其功能单位——卵泡的发育状态直接决定了雌性的生殖潜力。卵泡发育受到内分泌信号（如促性腺激素）和局部卵巢因子（如生长因子和细胞因子）的协同调控。其中，颗粒细胞(Granulosa cells, GCs)作为卵泡内的核心功能细胞，通过与卵泡膜细胞和卵母细胞协调， critically 主导着卵泡生长、排卵、黄体功能和类固醇激素合成等关键生殖事件。颗粒细胞直接通过其增殖和分化状态调控这些过程，尤其在类固醇激素合成和卵泡成熟中扮演着关键角色。因此，阐明颗粒细胞增殖的调控机制对于理解卵巢生理学至关重要。

神经介素B(Neuromedin B, NMB)作为哺乳动物蛙皮素样肽家族成员，是一种由10个氨基酸组成的十肽。NMB广泛分布于中枢神经系统和周围组织（如胃肠道和性腺），通过结合特异性受体并激活下游信号通路介导多种生物学功能。值得注意的是，NMB及其受体在人类和小鼠等模式生物的生殖系统中高表达，提示它们在生殖功能中具有潜在的调控作用。此外，研究表明NMB能增强雌性小鼠促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)神经元的兴奋性，促进下丘脑GnRH分泌，进而调控垂体黄体生成素(Luteinizing hormone, LH)的释放，表明其可能通过下丘脑-垂体-卵巢轴参与卵泡发育。这些发现表明，NMB介导的生殖功能调控涉及多通路、多基因和多因子，但其精确机制仍有待阐明。

另一方面，线粒体和内质网(Endoplasmic reticulum, ER)是调控细胞生物学功能的核心细胞器。大约5%-20%的线粒体外膜与内质网形成高度动态的物理接触，称为线粒体相关内质网膜(Mitochondria-associated ER membranes, MAMs)。MAMs的形成不仅仅是细胞器间的膜接触，更是一个复杂且高度调控的过程。MAMs介导钙离子(Ca²⁺)、磷脂和代谢物在两个细胞器间的传递，从而调控脂质代谢、线粒体动力学、内质网应激反应、钙稳态和细胞命运。值得注意的是，MAMs的形成对于胆固醇从内质网到线粒体的最佳转移至关重要，并且是启动线粒体类固醇生成的中心枢纽，提示MAMs在生殖调控中扮演着关键角色。同时，研究表明高脂饮食会增加小鼠生殖细胞中MAMs相关蛋白的水平，升高线粒体钙水平，并促进细胞凋亡。此外，环境内分泌干扰物暴露会诱导MAMs改变，从而破坏小鼠的卵巢功能。这些观察结果强调了MAMs在卵泡发育中的潜在重要性。

尽管NMB在生殖系统中的存在已被察觉，但其在卵巢卵泡发育，特别是在颗粒细胞功能中的直接作用和具体分子机制仍然模糊不清。颗粒细胞如何感知NMB信号？该信号又如何转化为调控细胞增殖的细胞内事件？这些问题的答案对于全面理解卵巢生理学和开发提高繁殖效率的策略具有重要意义。

本研究以山羊颗粒细胞为模型，结合NMB处理及其受体NMBR拮抗剂实验，旨在揭示NMB通过结合NMBR调控内质网和细胞内Ca²⁺稳态，进而影响山羊颗粒细胞增殖和细胞周期进程的机制。研究人员进一步探讨了NMB-NMBR相互作用如何调控MAMs的结构偶联效率及其对线粒体功能和动力学的影响。

本研究主要应用了以下关键技术方法：从屠宰场收集山羊卵巢并分离不同直径卵泡的颗粒细胞进行体外培养；使用NMB肽段和NMBR拮抗剂PD168368进行细胞干预；通过qRT-PCR和Western blot检测基因和蛋白表达；利用免疫组织化学和免疫荧光进行蛋白定位；采用EdU掺入法和流式细胞术评估细胞增殖和周期分布；使用钙离子检测试剂盒和特异性荧光探针测定胞浆、内质网和线粒体Ca²⁺水平；通过透射电子显微镜观察线粒体超微结构和MAMs；应用JC-1染色、ATP检测、线粒体呼吸链复合物活性测定和活性氧检测评估线粒体功能；利用小干扰RNA(siRNA)敲低XBP1S基因表达；并通过免疫共沉淀验证蛋白间相互作用。

动态表达 of NMB and its receptors in ovarian follicle development of goats

为了探究NMB及其受体在卵巢卵泡发育中的作用，研究人员首先克隆并分析了山羊NMB及其受体的结构，发现其核苷酸序列在物种间高度保守。跨膜拓扑预测显示NMBR和GRPR均具有七个跨膜结构域。随后，他们检测了NMB及受体在3月龄和9月龄山羊卵巢中的表达和定位。与3月龄相比，9月龄卵巢中NMB和GRPR的mRNA和蛋白水平显著升高，而NMBR表达则显著降低。免疫组织化学结果显示，NMB及其受体在卵巢卵泡的颗粒细胞中均有表达。此外，对不同直径卵泡的分析表明，NMB和GRPR的mRNA和蛋白相对表达水平随着卵泡直径的增大而显著增加，而NMBR的基因和蛋白表达水平则显著降低。免疫荧光实验进一步证实NMB和NMBR主要定位于颗粒细胞的细胞质，而GRPR在细胞核和细胞质中均有表达。这些发现表明NMB及其受体可能参与调控山羊卵泡的发育。

NMB promotes goat GC proliferation via NMBR

为了研究NMB对山羊颗粒细胞增殖的影响，研究人员用不同浓度的NMB处理细胞。结果发现，10^-7 M的NMB处理能显著促进颗粒细胞增殖。时间梯度分析显示，10^-7 M NMB处理3至24小时，细胞增殖呈时间依赖性增加，并伴随PCNA mRNA和蛋白表达的相应变化。为了确定介导NMB效应的受体，他们评估了NMBR和GRPR拮抗剂的作用。GRPR拮抗剂RC-3095在所测试浓度下对PCNA蛋白水平无剂量依赖性影响，而NMBR拮抗剂PD168368则显著抑制了NMB诱导的增殖，并显著降低了PCNA的mRNA和蛋白表达。这些结果表明NMB主要通过结合NMBR来增强山羊颗粒细胞的增殖能力。进一步通过流式细胞术分析细胞周期分布发现，与对照组相比，NMB处理显著增加了S期细胞的比例，而NMBR拮抗剂与NMB共处理则显著减少了S期细胞数。同时，NMB显著上调了细胞周期蛋白E1(Cyclin E1, CCNE1)和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2, CDK6, CDK1)的蛋白表达，这些增加均可被NMBR拮抗剂抑制。这些数据表明NMB通过NMBR调控颗粒细胞的细胞周期进程。

NMB regulates Ca²⁺ in goat GCs via activating the NMBR-PLCβ1-IP3R pathway

为了探究NMB是否通过影响Ca²⁺稳态来调控山羊颗粒细胞增殖，研究人员首先测量了细胞内Ca²⁺水平。结果显示，NMB处理显著提高了山羊颗粒细胞中的Ca²⁺浓度，而拮抗NMBR则显著降低了Ca²⁺水平。他们随后检测了内质网钙通路关键蛋白的表达变化，发现NMB处理显著上调了PLCβ1和IP3R的蛋白表达，而NMBR拮抗剂逆转了这些效应。同时，NMB处理组的ER Ca²⁺荧光强度显著降低，但在加入NMBR拮抗剂后恢复。ER-Tracker染色显示，NMB处理增强了荧光强度且内质网形态均匀，而拮抗剂处理组荧光减弱提示内质网功能异常。这些数据证明NMB通过NMBR-PLCβ1-IP3R轴调控细胞内Ca²⁺稳态，进而调节颗粒细胞的细胞周期进程和增殖。

NMB enhances the proliferation ability of goat GCs by regulating the IRE1a pathway of UPR^ER through NMBR

为了进一步阐明NMB通过内质网影响山羊颗粒细胞增殖的机制，研究人员检测了内质网未折叠蛋白反应(Unfolded protein response in the ER, UPR^ER)三个关键调控通路相关蛋白的表达。结果显示，与对照组相比，NMB处理显著降低了磷酸化IRE1a和XBP1S的表达，而NMBR拮抗剂与NMB共处理则显著上调了磷酸化IRE1a和XBP1S的表达水平。相比之下，ATF6和ERp57的表达在NMB处理后下调，但拮抗剂单独或与NMB共处理均未改变其水平。同样，PERK通路蛋白在所有处理组中均无变化。鉴于这些发现，研究人员随后合成了XBP1S siRNA，以评估在NMB处理下XBP1S对山羊颗粒细胞增殖的影响。结果显示，转染XBP1S靶向siRNA后，XBP1S的蛋白表达水平下调，其中siXBP1S-610(siXBP1S)显示出最高的敲低效率（>55%）。此外，XBP1S敲低抑制了颗粒细胞增殖，并阻碍了细胞周期从G1期向S期的转换。然而，添加NMB处理挽救了由XBP1S缺陷引起的增殖受损。这些结果证明，NMB与NMBR的结合通过调控Ca²⁺稳态，进而调节UPR^ER的IRE1a通路，最终影响山羊颗粒细胞的细胞周期和增殖。

NMB regulates mitochondrial morphology and function through NMBR

为了研究NMB对线粒体形态的影响，研究人员使用Mito Tracker进行荧光染色并通过共聚焦显微镜观察。结果显示，NMB处理诱导了山羊颗粒细胞中的线粒体融合，其特征是 elongated 线粒体的比例增加，而拮抗NMBR则引发了线粒体分裂。透射电子显微镜证实，NMB处理的细胞线粒体变长，长度和直径增加，而NMBR拮抗剂导致线粒体结构损伤，包括嵴紊乱和基质苍白。定量形态分析表明，NMB显著增加了线粒体的面积、周长、长宽比和形状因子。此外，研究人员检测了线粒体融合和分裂关键蛋白的表达。NMB处理显著上调了线粒体融合蛋白MFN1、MFN2和OPA1的表达，同时下调了分裂蛋白DNM1L的表达。然而，NMBR拮抗剂与NMB共处理逆转了NMB对线粒体融合和分裂蛋白表达水平的影响。为了研究NMB对线粒体功能的影响，研究人员测量了NMB处理的山羊颗粒细胞的线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential, MMP)、ATP产量、线粒体呼吸链复合物(Mitochondrial respiratory chain complexes, MRC)活性以及细胞活性氧水平。结果揭示，NMB显著提高了MMP、ATP产量以及MRC复合物CI-CV的活性，同时降低了细胞ROS的产生。然而，NMBR拮抗剂与NMB共处理逆转了NMB诱导的这些效应。这些发现表明，NMB通过与NMBR结合，通过调控线粒体动力学来调节线粒体功能，进而调控山羊颗粒细胞的增殖能力。

NMB-NMBR regulates Ca²⁺ transport in goat GCs via MAMs

为了阐明NMB如何影响Ca²⁺转运从而调控山羊颗粒细胞增殖，研究人员测量了NMB处理后颗粒细胞中ER、胞浆和线粒体的Ca²⁺水平。NMB显著降低了ER Ca²⁺水平，同时显著升高了胞浆和线粒体Ca²⁺水平。由于MAMs介导细胞器间的Ca²⁺流动，研究人员通过透射电镜观察了超微结构的MAMs。NMB增加了ER-线粒体接触位点，表现为MAMs相关的ER长度与线粒体周长的比值升高；NMBR拮抗剂逆转了这一效应。补充性的ER和线粒体探针共染色显示，合并图像中黄色重叠增加，表明MAMs形成。荧光共定位分析表明，NMB处理显著增强了山羊颗粒细胞中的MAMs偶联，而NMBR拮抗剂与NMB共处理则显著降低了MAMs偶联。IRE1a与IP3R发生物理相互作用以调节线粒体和ER之间的钙流。实验显示，与对照组相比，NMB处理显著上调了山羊颗粒细胞中IRE1a和IP3R的蛋白表达水平。此外，免疫共沉淀实验证实了IRE1a和IP3R之间存在相互作用。这些结果证明，NMB与NMBR的结合通过IRE1a-IP3R-VDAC1通路调控MAMs结构，从而调节线粒体和ER之间的细胞器间Ca²⁺流动，影响山羊颗粒细胞增殖。

本研究系统性地阐明了NMB通过结合其受体NMBR，激活PLCβ1-IP3R信号通路，调控内质网钙离子释放，维持细胞内钙稳态，并减轻内质网应激。同时，NMB-NMBR信号通过IRE1a-IP3R-VDAC1轴增强了线粒体相关内质网膜的形成，促进了钙离子向线粒体的转移，进而诱导线粒体发生代谢重编程——包括提升线粒体膜电位、增强呼吸链复合物活性、增加ATP合成以及促进线粒体网络融合，最终驱动山羊颗粒细胞的增殖和细胞周期进程。这项研究不仅拓展了对NMB在生殖生物学中功能的认识，为钙信号介导的细胞器对话在增殖调控中的作用提供了新的证据，而且为优化繁殖效率和治疗卵巢功能障碍提供了潜在靶点。该研究成果发表在《Journal of Ovarian Research》上，为生殖生物学领域提供了重要的理论依据和创新视角。