新型SERPINC1基因杂合突变c.473T>A(p.Leu158Gln)导致复发性动静脉血栓形成的临床与功能表征研究

《Thrombosis Journal》：Clinical and functional characterization of a novel heterozygous mutation c.473T?>?A (p.Leu158Gln) in the SERPINC1 gene causing recurrent arteriovenous thrombophilia

本研究针对一例年轻男性复发性动静脉血栓形成病例，通过血栓形成倾向筛查和基因分析发现新型SERPINC1基因c.473T>A(p.Leu158Gln)杂合错义突变。研究人员构建野生型和突变型表达载体，采用免疫印迹、ELISA、免疫荧光等技术证实该突变导致抗凝血酶分泌减少、胞质聚集和功能活性降低，首次系统阐明该突变引起I型遗传性抗凝血酶缺陷的分子机制，为临床诊断和治疗提供重要依据。

　　

在血栓性疾病研究领域，遗传性抗凝血酶缺陷（Hereditary Antithrombin Deficiency, HATD）一直被视为"隐形杀手"。这种由SERPINC1基因突变引起的罕见疾病，使患者血浆中最重要的天然抗凝物质——抗凝血酶（Antithrombin, AT）功能受损，导致凝血-抗凝血平衡被打破。更令人担忧的是，这些患者往往在青年时期就遭遇首次血栓事件，且血栓容易复发，可能发生在下肢深静脉、肺血管等部位，甚至波及脑静脉、肠系膜静脉等罕见部位。虽然动脉血栓传统上被认为与动脉粥样硬化关系更密切，但近年来的临床观察发现，抗凝血酶缺陷患者同样面临动脉血栓的威胁，这为临床诊断和治疗带来了新的挑战。

正是在这样的背景下，南京大学医学院附属南京鼓楼医院心血管内科的研究团队在《Thrombosis Journal》上发表了一项引人入胜的研究。他们遇到了一位特殊的病例：一名37岁男性患者，从19岁开始就反复遭遇血栓袭击——先是脑静脉血栓，然后是肠系膜静脉血栓需要部分小肠切除，最终在本次就诊时发生了心肌梗死。这种跨越动静脉系统、多次复发的血栓形成模式，立即引起了研究人员的警觉。

为了揭开这个临床谜题，研究人员开展了一系列深入探索。首先，他们对患者进行了全面的血栓形成倾向评估，发现其抗凝血酶活性显著降低至46.2%（正常范围103.2-113.8%），而其他血栓风险因素如抗心磷脂抗体、同型半胱氨酸等均在正常范围。这一线索将目光聚焦于SERPINC1基因。通过基因测序，他们在患者身上发现了一个前所未有的杂合错义突变c.473T>A，导致蛋白质第158位亮氨酸被谷氨酰胺取代（p.Leu158Gln）。家系分析显示，患者的母亲和女儿同样携带该突变且表现出抗凝血酶活性降低，而父亲和妻子则无此突变且活性正常，符合常染色体显性遗传模式。

在技术方法层面，研究人员主要采用了以下关键技术：通过Sanger测序进行SERPINC1基因突变筛查；构建野生型和突变型（p.Leu158Gln）SERPINC1表达质粒并在HEK293T细胞中进行瞬时转染；利用免疫印迹技术分析蛋白质表达和迁移特性；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量检测细胞上清液中抗凝血酶含量；通过免疫荧光观察蛋白质亚细胞定位；使用BIO-PHEN AT（Anti-IIa）显色法测定抗凝血酶活性；并运用生物信息学工具进行进化保守性、致病性预测和蛋白质结构分析。

病例展示

这位37岁男性患者因胸痛就诊，有丰富的血栓病史：19岁时发生脑静脉血栓，29岁时出现肠系膜静脉血栓需要手术治疗。本次冠状动脉造影显示右冠状动脉近端闭塞伴大量血栓负荷，经血栓切除和球囊血管成形术后成功实现血运重建。尽管出院后接受了氯吡格雷和利伐沙班联合治疗，但三个月后随访造影显示右冠状动脉再次闭塞，将抗凝方案更换为达比加群酯后未再发生血栓事件。实验室检查显示抗凝血酶活性显著降低（46.2%），而其他凝血参数基本正常。

基因测序与分析

基因测序结果显示患者携带SERPINC1基因c.473T>A（p.Leu158Gln）杂合错义突变，该突变在HGMD数据库中未见报道。家系分析证实这一突变与抗凝血酶活性降低共分离：母亲（51.9%）和女儿（55%）同样携带突变且活性降低，而父亲和妻子无突变且活性正常。进化保守性分析显示Leu158位点高度保守（PhyloP评分：0.101；PhastCons评分：0.995）。多种生物信息学预测工具一致将该突变归类为致病性。

HEK-293T细胞中表达和分布的测定

研究人员成功构建了SERPINC1野生型和SERPINC1-（p.Leu158Gln）表达质粒。Western blot结果显示，细胞裂解物中野生型和突变型抗凝血酶蛋白表达水平相当，但突变蛋白在不同凝胶浓度下均显示出更快的迁移速率。功能评估表明，转染SERPINC1-（p.Leu158Gln）的细胞上清液中抗凝血酶表达量和活性均显著降低。

免疫荧光

免疫荧光研究显示，两组中抗凝血酶均定位于细胞质，总体荧光强度相似。然而，与野生型抗凝血酶均匀分布相比，突变型抗凝血酶显示出明显的细胞质聚集模式。

生物信息学分析

PyMOL 2.6.0分析显示，在SERPINC1-（p.Leu158Gln）突变体中，D螺旋的Leu158残基被Gln取代。糖基化模式预测表明该突变不影响Asn128、Asn167、Asn187和Asn224四个N-连接糖基化位点。同时，三对二硫键（Cys40-Cys160、Cys128-Cys182、Cys247-Cys430）的完整性也确认未受突变影响。

讨论与结论

本研究系统探讨了SERPINC1基因p.Leu158Gln突变在家族性复发性多部位动静脉血栓形成中的致病机制。研究发现该突变导致抗凝血酶分泌受损、胞质滞留和功能活性降低，符合I型HATD的特征。结构分析表明Leu158位于抗凝血酶D螺旋内，该区域构成肝素结合域，而肝素能够将抗凝血酶的抑制活性增强100至1000倍。虽然p.Leu158Gln替代不直接影响二硫键形成或糖基化模式，但可能通过构象变化影响蛋白质分泌和功能。

临床治疗方面，该病例揭示了抗凝血酶缺陷患者抗凝治疗的复杂性。患者最初对利伐沙班反应不佳，可能与这种Xa因子抑制剂的作用部分依赖抗凝血酶介导的间接抑制有关。而转换为直接凝血酶抑制剂达比加群酯后，成功预防了血栓复发，提示直接凝血酶抑制剂可能更适合严重抗凝血酶缺陷患者。此外，家系分析发现尽管母亲和女儿携带相同突变且抗凝血酶活性降低，但均无血栓事件，显示该突变存在不完全外显，女性可能受到雌激素介导的保护效应。

本研究首次全面表征了SERPINC1 p.Leu158Gln突变引起I型HATD的分子机制，为理解该疾病的基因型-表型关联提供了重要见解。研究结果强调了对年轻血栓患者进行全面血栓形成倾向筛查的重要性，特别是对于具有复发性或动静脉混合性血栓特征的患者。同时，研究也为个体化抗凝治疗策略的选择提供了实验依据，对改善HATD患者的临床预后具有重要指导意义。