NEDD4L通过泛素化调控Gasdermin D和E稳定性抑制细胞死亡和组织损伤的新机制

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：NEDD4L-mediated Gasdermin D and E ubiquitination regulates cell death and tissue injury

本刊推荐：为阐明Gasdermin（GSDM）蛋白稳定性的调控机制，研究人员开展了NEDD4L介导的GSDMD和GSDME泛素化研究。发现NEDD4L通过K11/K29/K63等多泛素链修饰GSDMD的K51/K203/K204位点和GSDME的K39/K40/K120/K440位点，促进其蛋白酶体降解。Nedd4-2基因敲除小鼠表现为肺肾损伤，高钠饮食诱发肾小管上皮细胞GSDM激活、caspase-3切割和IL-1β释放。该研究首次揭示E3连接酶NEDD4L通过调控GSDM稳定性抑制细胞死亡的新通路，为相关疾病治疗提供新靶点。

　　

在细胞死亡研究领域，Gasdermin（GSDM）蛋白家族作为焦亡（pyroptosis）的关键执行者一直备受关注。这些膜孔形成蛋白不仅参与炎症反应，还与癌症、自身免疫疾病等多种病理过程密切相关。然而，科学家们对GSDM蛋白在细胞内的稳定性调控机制知之甚少，特别是哪些分子能够像"刹车"一样控制这些"死亡执行者"的活性，防止它们过度激活导致组织损伤。

近日发表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》的研究论文首次揭示了E3泛素连接酶NEDD4L（小鼠中称为NEDD4-2）作为GSDMD和GSDME的关键调控因子。由Sonia S. Shah和Sharad Kumar领导的研究团队发现，NEDD4L通过泛素化修饰精确控制这两种Gasdermin蛋白的稳定性，从而防止细胞过度死亡和组织损伤。这一发现不仅解答了GSDM蛋白稳定性调控的基本生物学问题，也为相关疾病的治疗提供了新的分子靶点。

研究人员运用了多项关键技术方法：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建NEDD4L敲除细胞系；利用免疫共沉淀和双分子荧光互补技术验证蛋白质相互作用；采用体外泛素化 assay 分析酶活性；通过环己酰亚胺追踪实验测定蛋白质半衰期；使用高钠饮食诱导的小鼠模型评估病理表型；并借助沙门氏菌感染实验验证生理功能。

NEDD4L调控Gasdermin D和E的稳定性

研究团队首先通过生物信息学预测发现GSDMD和GSDME可能是NEDD4L的潜在底物。实验证实，在NEDD4L敲除的肾皮质集合管细胞（CCD）和THP-1细胞中，GSDMD和GSDME蛋白水平显著升高。环己酰亚胺追踪实验显示，NEDD4L缺失使GSDMD和GSDME的半衰期明显延长，表明NEDD4L确实调控这两种蛋白的稳定性。

NEDD4L与GSDMD和GSDME的直接相互作用

为了验证NEDD4L是否直接作用于GSDMD和GSDME，研究人员进行了免疫共沉淀实验。结果显示，内源性NEDD4L能够与内源性GSDMD和GSDME蛋白结合。双分子荧光互补（BiFC）实验进一步证实了这种直接相互作用，当VN-NEDD4L与VC-GSDMD或VC-GSDME共表达时，会产生明显的Venus荧光信号。

NEDD4L介导GSDMD和GSDME的泛素化

研究人员通过体外泛素化实验证实，NEDD4L能够直接泛素化GSDMD和GSDME，而催化活性位点Cys942Ala突变体则丧失了这一功能。进一步实验表明，NEDD4L介导的泛素化主要导致GSDMD和GSDME通过蛋白酶体途径降解。在NEDD4L敲除细胞中，GSDMD和GSDME的多泛素化水平显著降低。

鉴定GSDMD和GSDME的泛素化位点及链型

通过点突变和特异性泛素链载体，研究人员精确鉴定了NEDD4L介导的泛素化位点：GSDMD主要在N端结构域的K51、K203和K204位点被泛素化，形成K11、K29和K63连接的多泛素链；而GSDME则在N端结构域的K39、K40、K120和C端结构域的K440位点被泛素化，形成K6、K29、K48和K63连接的多泛素链。这种特异的泛素链构象可能决定了底物的不同细胞命运。

NEDD4L缺失加剧细胞死亡

功能实验表明，NEDD4L敲除细胞在NLRP3激动剂（尼日利亚霉素、ATP、MSU）处理后，表现出更强的GSDMD和GSDME激活、LDH释放和细胞死亡。特别是在多柔比星诱导的CCD细胞中，NEDD4L缺失导致caspase-3和caspase-8激活，GSDMD和GSDME切割增加，而NEDD4L重新表达可逆转这一现象。

NEDD4L缺陷加剧感染诱导的细胞死亡

沙门氏菌感染实验显示，NEDD4L敲除的THP-1巨噬细胞表现出更高的细菌负载量、细胞死亡率和IL-1β释放，同时伴随GSDMD、GSDME和caspase-3的激活，表明NEDD4L在抵抗细菌感染中起保护作用。

小鼠模型验证生理病理意义

在Nedd4-2基因敲除小鼠中，研究人员观察到组织特异性调控：肺部主要表现为GSDMD升高，而肾脏则主要表现为GSDME升高。肾小管特异性Nedd4-2敲除小鼠（Nedd4-2^Ksp1.3）在高钠饮食后出现GSDM激活、肾小管细胞死亡和肾功能下降，伴随巨噬细胞和中性粒细胞浸润，表明GSDM介导的细胞死亡加剧了组织损伤。

本研究首次系统阐明了NEDD4L通过泛素化降解GSDMD和GSDME调控细胞死亡的新机制。这不仅深化了对Gasdermin蛋白稳定性调控的理解，还为相关疾病（如肾损伤、肺疾病、感染性疾病）的治疗提供了新的分子靶点。NEDD4L作为重要的分子"刹车"，通过控制GSDM蛋白水平防止过度细胞死亡，这一发现具有重要的理论价值和临床转化意义。