抗CD3抗体重复给药对NOD小鼠新发糖尿病的疗效与免疫机制研究

《Diabetologia》：Redosing of anti-CD3 antibodies in NOD mice with new-onset diabetes does not alter the effect of a single treatment course

本研究针对抗CD3抗体teplizumab在临床重复给药中的疗效不确定性，通过建立新发糖尿病NOD小鼠模型，系统评估了早期与晚期重复给药对疾病逆转及免疫应答的影响。结果表明，单次低剂量抗CD3治疗可逆转43%小鼠的糖尿病，但重复给药未能增强非应答者的疗效，亦未破坏应答者的免疫耐受。研究进一步揭示，应答者胰腺中T细胞向幼稚表型转化且衰竭性T细胞增多，而非应答者自然杀伤（NK）细胞浸润显著，提示先天免疫参与治疗抵抗。该成果为优化抗CD3疗法临床策略提供了关键实验依据。

　　

在全球范围内，有近940万人正承受着1型糖尿病的困扰，这是一种由T细胞介导的自身免疫性疾病，患者胰腺中产生胰岛素的β细胞会遭受选择性破坏。更令人担忧的是，还有约230万人处于无症状的1型和2型糖尿病前期阶段，这为早期干预提供了关键窗口。近年来，teplizumab作为一种人源化抗CD3单克隆抗体，已获多个监管机构批准，用于延缓8岁及以上、自身抗体阳性且β细胞功能受损但无临床症状的个体（2型糖尿病阶段）向症状性糖尿病（3型糖尿病阶段）的进展。在关键临床试验中，单次14天的teplizumab疗程可将进展至3型糖尿病的中位时间延迟近5年，凸显了短期治疗后在血糖管理和持久免疫调节方面的巨大潜力。

然而，随着teplizumab在临床中的推广应用，一系列关键问题亟待解答。其中，重复给药的策略尤为引人关注。早期临床试验如AbATE、Delay、Protégé和Encore表明，在6型糖尿病患者中，为期6、12或14天的teplizumab静脉输注（有时间隔6或12个月进行第二次疗程）能在2年内减缓β细胞功能下降的速度。接受治疗的患者能维持更好的血糖控制，减少外源性胰岛素的需求。最近的PROTECT试验也显示，间隔6个月的两个12天teplizumab疗程改变了儿童和青少年3型糖尿病患者的C肽下降曲线。尽管各试验在疾病阶段、病程、诊断年龄、药物剂量和治疗方案上存在差异，但C肽的产生尤其在治疗后前6个月增加，随后恶化，这促使了在6或12个月时重复给药以延长反应。然而，50-85%的参与者产生了抗药物抗体（ADA），这可能潜在地降低疗效。

一个关键的下一步是确定重复的teplizumab疗程对于维持或增强其治疗效果是否是必要的，特别是在表现出免疫调节减弱迹象的个体中。来自AbATE、Delay和TN10试验的机制见解表明，临床应答者循环中CD8⁺ T细胞频率增加，表现出部分衰竭的表型，以T细胞免疫受体与Ig和ITIM结构域（TIGIT）、杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1（KLRG1）和Eomesodermin（EOMES）的表达为标志。这些表型变化大约在治疗后6个月达到峰值，但在18个月时恢复到基线水平，尽管一些个体仍然存在临床获益。最近的一项研究进一步描述了teplizumab的免疫调节作用，揭示了在治疗后3个月早期富集了免疫激活相关基因和通路，随后在18个月时转向与免疫调节和T细胞衰竭相关的转录谱。尽管取得了这些进展，但关于持续疾病调节背后的机制仍然存在关键问题。

在此背景下，研究人员在《Diabetologia》上发表了最新研究，旨在探讨在新发糖尿病的NOD小鼠模型中，初始治疗（第0-4天）后早期（第14-18天）或晚期（第43-47天）给予第二疗程抗CD3治疗对疾病逆转、ADA产生和免疫调节的影响。该研究使用了低剂量的抗CD3抗体，以在NOD小鼠中诱导应答者和非应答者表型。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术方法：首先，他们建立了新发糖尿病NOD小鼠模型，并随机分为单次治疗、早期重复给药和晚期重复给药等不同处理组。其次，通过流式细胞术（特别是16标记光谱流式细胞术）深入分析了外周血、胰腺和胰腺引流淋巴结（PLN）中的免疫细胞亚群动态变化，包括T细胞（CD4⁺, CD8⁺）、调节性T细胞（Treg, Foxp3⁺）、衰竭性T细胞（PD1⁺KLRG1⁺）和自然杀伤（NK, NKp46⁺CD3^-）细胞等。第三，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）监测了小鼠血浆中抗药物抗体（ADA）的滴度随时间的变化。第四，采用多重细胞因子检测技术（如U-PLEX Proinflam Combo kit）定量分析了血浆中多种促炎细胞因子（如IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-10）的水平，以评估细胞因子释放综合征（CRS）的情况。

Redosing anti-CD3 fails to improve diabetes reversal or break the initial therapeutic effect in new-onset diabetic NOD mice

基于先前研究，研究人员对新发糖尿病的NOD小鼠（n=40）施以短期（第0-4天）低剂量抗CD3（2.5μg/天，克隆145-2C11）治疗，成功逆转了43%（17/40只）小鼠的糖尿病。为评估第二疗程抗CD3是否能改善治疗效果，他们测试了早期和晚期重复给药方案。早期重复给药组（n=15）在初始治疗开始后14天（第14-18天）接受第二个5天疗程，此时正值首次疗程后外周血CD3⁺ T细胞重新出现。结果显示，初始治疗无应答的小鼠在早期第二疗程后均未实现疾病逆转（0/10）。而初始应答的小鼠在早期第二疗程后均保持血糖正常（5/5）。晚期重复给药组（n=28）在初始治疗开始后43天（第43-47天）接受第二个5天疗程，此时首次抗CD3治疗后ADA滴度已开始下降。同样，对初始治疗无应答的小鼠在晚期第二疗程后也未实现糖尿病逆转（0/5）。而应答小鼠均保持血糖正常（23/23）。较高的起始血糖值（≥19.4 mmol/L）预示着无应答，这与先前数据一致。这些结果表明，无论早期还是晚期重复给药，均未能为初始无应答者提供额外治疗益处，但也未损害应答者已重建的免疫耐受。

Immunomodulatory effects of anti-CD3 in peripheral blood

为了评估抗CD3治疗的免疫调节作用，研究人员应用16标记光谱流式 panel 评估外周血免疫亚群的动态变化。UMAP分析用于特异性映射T和NK细胞。单次低剂量抗CD3疗程在第4天诱导了应答和非应答小鼠CD3⁺ T细胞的短暂耗竭，这主要归因于CD4⁺ T细胞比例的减少，并伴有CD8⁺ T细胞比例的增加，导致CD4⁺/CD8⁺ T细胞比率降低。进一步分析显示，CD4⁺ T细胞的减少主要是由于幼稚（CD62L⁺CD44^-）和中央记忆（T_CM: CD62L⁺CD44⁺）T细胞的耗竭，而效应记忆（T_EM: CD62L^-CD44⁺）T细胞亚群基本未受影响。在CD8⁺ T细胞区室中，幼稚细胞减少不明显，而效应记忆细胞亚群则有所增加。有趣的是，所有小鼠在第4天时Foxp3⁺调节性T细胞（Treg）的比例均有所增加。在CD8⁺ T细胞中，也观察到幼稚细胞的减少和效应细胞的显著增加。值得注意的是，衰竭性（PD1⁺KLRG1⁺）CD8⁺ T细胞的比例在第4天短暂扩增。此外，首次抗CD3疗程后，NK（NKp46⁺CD3^-）细胞比例也出现暂时性倍增。重要的是，大多数免疫细胞亚群的频率在观察期结束时（第74天）恢复到基线水平，但幼稚CD4⁺ T细胞除外。

随后给予早期第二疗程抗CD3导致CD3⁺ T细胞出现轻微下降（与首次疗程相比），应答和非应答小鼠情况相似。这归因于CD4⁺和CD8⁺ T细胞的下降，导致CD4⁺/CD8⁺ T细胞比率仅轻微降低。该疗法对幼稚CD4⁺ T细胞产生了最强且最持久的耗竭作用。与首次疗程不同，早期重复给药后Treg比例下降，并且衰竭性CD8⁺ T细胞表型未被（再）诱导。

在第43天开始的晚期第二疗程产生了相反的效果，具体取决于治疗反应。在应答小鼠中，恢复中的CD3⁺ T细胞频率再次下降，而在无应答者中则增加。这些差异反映在CD4⁺/CD8⁺ T细胞比率上，在应答小鼠中进一步降低，在无应答小鼠中增加。此外，所有小鼠的Treg频率短暂增加，但从未达到首次疗程观察到的水平。值得注意的是，早期和晚期重复给药均未（再）诱导CD8⁺ T细胞衰竭（PD1⁺KLRG1⁺）。首次治疗后显著的NK细胞扩增，在第二次疗程后（无论时机如何）均未出现。

Induction of ADAs and proinflammatory markers

治疗药物的免疫原性是导致重复给药无效的主要原因之一。研究人员在多个时间点收集了抗CD3治疗小鼠的血浆以研究ADA的产生。所有小鼠在首次疗程后均产生可检测的ADA反应，滴度在第14天达到峰值（较基线增加37倍）。ADA滴度在第43天逐渐下降38%；然而，水平仍保持在基线以上约23倍，之后进一步下降至基线以上约4倍。在ADA滴度峰值时进行早期重复给药，在应答小鼠中诱导了显著的继发性ADA反应（53倍较基线），而在无应答小鼠中，滴度与第14天相当，仍代表较基线增加35倍。到第43天，应答小鼠的ADA滴度下降更快（较第18天下降23%），而非应答小鼠仅下降3%。到研究终点时，ADA滴度进一步下降至基线以上6倍。相比之下，当在ADA水平下降后给予第二疗程时，两组均观察到滴度急剧上升92%（较基线46倍），并在第56天达到峰值（较基线66倍）。在研究终点，ADA滴度仍保持升高（较基线38倍）。这些数据表明，重复给予抗CD3会导致强烈的继发性ADA反应，无论初始反应如何，这可能会降低抗CD3的生物利用度并损害疗效。

细胞因子释放综合征（CRS）是免疫过度活化和过度细胞因子分泌的结果，可能影响药物代谢和疗效，但如果管理得当，也可能是治疗效应的必要组成部分。研究人员评估了低剂量抗CD3方案后促炎标志物的血浆动力学。单次疗程后，IFN-γ在所有小鼠中于第4天上升30倍，但在第14天时，应答小鼠下降更显著（5倍 vs 2倍）。TNF-α和IL-6分别增加16倍和6倍，之后逐渐下降。IL-10上升11倍，并在应答小鼠中保持升高（第43天时8倍），但在非应答小鼠中恢复至基线。其他细胞因子和趋化因子（IL-1β, MCP-1, IP-10）也有升高，但无显著组间差异。

对第二疗程的细胞因子反应取决于时机和治疗结果。IFN-γ在应答小鼠中上升2倍（早期）和12.5倍（晚期），但在非应答小鼠中无变化。早期重复给药在应答小鼠中适度增加TNF-α和IL-6，但在非应答小鼠中降低它们；晚期重复给药的反应与初始反应相似。早期重复给药后，IL-10在应答小鼠中上升1.5倍，但在非应答小鼠中下降；然而，其水平下降速度快于单次疗程后（第43天时2倍 vs 8倍）。晚期重复给药后，IL-10在非应答小鼠中轻微上升（2倍），但在应答小鼠中无变化。总体而言，IL-10在应答小鼠中保持较高水平。这些数据表明，低剂量抗CD3最初诱导强烈的细胞因子反应，重复给药的效果受时机和治疗反应的调节。

Immunomodulatory effects of anti-CD3 in the pancreas and PLN

在研究结束时（第74天），研究人员对来自抗CD3治疗应答和非应答小鼠以及新发糖尿病NOD小鼠的胰腺和PLN的单细胞悬液应用16标记光谱流式 panel 进行了全面的免疫表型分析。UMAP分析用于可视化应答和非应答小鼠胰腺中免疫细胞的聚类。通过手动设门，在所有抗CD3治疗的小鼠中，无论其治疗反应或重复给药方案如何，均观察到胰腺中CD3⁺ T细胞频率较新发糖尿病对照组显著降低。这种降低在非应答小鼠中不如在应答小鼠和新发糖尿病对照组中明显，导致CD4⁺/CD8⁺ T细胞比率降低。同样，T细胞亚群组成的这种转变在PLN中不太明显。值得注意的是，与非应答小鼠相比，无论是单次疗程还是晚期第二疗程抗CD3治疗后，非应答小鼠胰腺和PLN中Foxp3⁺ Treg频率均升高。然而，在接受早期第二疗程的小鼠胰腺中，这种差异不明显。

重要的是，表现出衰竭表型（PD1⁺KLRG1⁺）的CD8⁺ T细胞在应答小鼠和新发糖尿病小鼠的胰腺中容易检测到，但在非应答小鼠中基本不存在，无论治疗方案如何。这种分布与我们在外周血中的观察结果平行，而在PLN中模式相反。在非应答小鼠中，胰腺中的CD4⁺和CD8⁺ T细胞表现出从幼稚（CD62L⁺CD44^-）表型向效应（T_EM: CD62L^-CD44⁺）表型的显著转变，这与治疗方案以及新发小鼠无关，指向一个更活化的免疫环境。这种转变也存在于PLN中，但程度较轻。中央记忆（T_CM: CD62L⁺CD44⁺）T细胞的频率在各治疗组的CD4⁺和CD8⁺ T细胞亚群中保持不变。最显著的是，无论治疗方案如何，非应答小鼠胰腺和PLN中的NK细胞频率均高于应答小鼠和新发糖尿病NOD小鼠，突显了NK细胞介导的机制在治疗抵抗中的潜在作用。

本研究深入探讨了在新发糖尿病NOD小鼠中早期和晚期重复给予抗CD3治疗的疗效，揭示了其有限的治疗益处。与NOD小鼠模型中的先前研究一致，单次短期低剂量抗CD3治疗（2.5μg/天，第0-4天）逆转了43%小鼠的糖尿病，从而可以研究应答者和非应答者表型。两种重复给药方案基于T细胞重新增殖（第14-18天）和ADA下降（第43-47天）而设计。然而，重复给予抗CD3（早期或晚期）未能为初始无应答小鼠提供额外的治疗益处，但幸运的是并未损害应答小鼠中重新建立的耐受性。这些发现反映了临床挑战，即在6个月（早期）或12个月（晚期）重复给予teplizumab在阻止非应答者β细胞衰退或延长应答者C肽保存方面显示出有限疗效，对第二疗程药物的潜在益处提出了质疑。

该研究揭示了小鼠抗CD3治疗与人类3型糖尿病teplizumab治疗之间的相似性和差异性。外周血光谱流式细胞术表明，初始抗CD3给药引起显著的CD3⁺ T细胞耗竭，与teplizumab的人体试验（如AbATE和Protégé）结果一致。然而，与人类中广泛的CD4⁺和CD8⁺ T细胞耗竭不同，小鼠显示出CD4⁺ T细胞（主要是幼稚细胞）的选择性丢失，相对保留了CD8⁺ T细胞。虽然临床试验报告了常规Foxp3^-CD4⁺ T细胞和Treg的减少，但本研究结果显示常规Foxp3^-CD4⁺ T细胞优先耗竭，导致循环Treg短暂富集。Valle等人曾在NOD小鼠中报告类似发现，将Treg抵抗性归因于较低的CD3表达。可能的潜在机制是T细胞亚群间CD3表达的差异，CD4⁺和幼稚T细胞比CD8⁺和效应/记忆细胞表现出更高的CD3表面水平，使它们对药物更敏感。研究人员还观察到抗CD3治疗后循环中幼稚CD8⁺ T细胞频率降低和效应CD8⁺ T细胞比例增加，与人类数据一致。总之，这些观察结果突显了抗CD3治疗如何通过其CD3表达和激活状态选择性重塑外周T细胞区室。尽管teplizumab应答者显示出部分衰竭循环CD8⁺ T细胞的基因特征，但本研究仅检测到PD1⁺KLRG1⁺CD8⁺ T细胞比例的短暂上升，而重复给药未能维持或重新诱导衰竭。未能重新诱导衰竭可能归因于免疫环境的转变，包括初始治疗后细胞因子谱的改变和T细胞池的重塑。胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）信号可以诱导T细胞衰竭并促进β细胞再生，这表明GLP-1R激动剂与抗CD3治疗联用可能通过靶向免疫和β细胞通路来改善结局。

研究结果强调，抗CD3治疗诱导了快速但无毒的细胞因子释放，在第4天达到峰值，可能由T细胞和先天免疫激活驱动。应答小鼠出现IFN-γ、TNF-α和IL-6的短暂峰值，随后是一个以持续IL-10水平为特征的免疫调节阶段。这表明了一种协调的免疫调节，其中初始激活之后是调节机制，可能抑制T细胞增殖，并可以支持Treg功能和稳定性。非应答小鼠也表现出短暂的促炎细胞因子升高，但未能建立后续的调节阶段，可能反映了持续的效应T细胞活性或耐受诱导受损。值得注意的是，在非应答小鼠中早期重复给予抗CD3并未诱导IL-10，尽管晚期重复给药引发了延迟的IL-10反应，但可能为时已晚，无法重编程免疫轨迹，并且大多数β细胞可能已经丧失。这与teplizumab治疗个体的临床观察一致，其中应答者表达更多IL-10相关细胞因子，如IL-20和IL-26。这些细胞因子谱可能在塑造免疫耐受和决定治疗结果方面起关键作用。

除了T细胞重塑，抗CD3治疗还影响循环NK细胞动态。初始抗CD3疗程后，外周血中NK细胞频率表现出短暂但强劲的倍增。这种比例增加与促炎细胞因子IL-6和TNF-α的释放同时发生，提示免疫激活。NK细胞频率迅速下降，并且在早期或晚期重复给药后均未重新扩增，伴随着减弱的细胞因子反应和降低的免疫调节功效。这些发现可能表明NK细胞在抗CD3治疗期间受到调节，并可能影响治疗反应。

抗CD3治疗的免疫调节功效在重复给药时显著降低，反映在CD3⁺ T细胞的耗竭极小，以及CD4⁺和CD8⁺ T细胞频率的适度降低。这种有限反应可能部分反映了初始疗程后的免疫适应，如受体下调或内化，限制了第二疗程的有效性。然而，ADA的产生被认为是重复给药的主要障碍。在本研究中，观察到初始抗CD3治疗后显著的ADA反应，滴度在第14天左右达到峰值。尽管这些滴度随时间下降，但晚期重复给药诱导了甚至更大程度的继发性ADA反应，表明针对异种抗体的记忆反应。另一方面，teplizumab由于异种性降低可能显示出更温和的免疫原性。Teplizumab是一种源自鼠源OKT3的人源化单克隆抗体，靶向T细胞受体（TCR）复合物的CD3ε亚基。为降低免疫原性，其Fc区具有丙氨酸（Ala）取代，并将鼠源互补决定区（CDR）移植到人IgG1骨架上，形成hOKT3γ1（Ala-Ala）。尽管如此，ADA形成仍然是值得关注的问题，据报道50-85%的治疗个体在治疗开始后4-8周就产生抗teplizumab抗体。这些抗体可能中和治疗功效，改变T细胞反应，并通过降低生物利用度和增加药物清除率来损害药代动力学。这些发现强调了使用完全人源化抗体以最小化ADA形成并在重复免疫调节干预中保持治疗效力的重要性。

NOD小鼠模型提供了罕见的机会来研究胰腺及其淋巴结，提供了对人类研究中通常难以获取的局部免疫动态的关键见解。与外周发现不同，胰腺免疫分析揭示了应答和非应答小鼠之间的主要差异。在所有治疗方案中，应答小鼠始终表现出更高的CD4⁺/CD8⁺ T细胞比率，伴随着从效应表型向幼稚表型的转变，以及具有衰竭表型的CD8⁺ T细胞，这两者都提示胰腺中免疫环境活化程度较低。这种转变在PLN中也观察到，但程度较轻。Bruggeman等人曾观察到随着1型糖尿病进展，T细胞表型从幼稚向效应转变。相比之下，研究终点时外周血仍显示幼稚CD4^+</sup