尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）鳃部接触亚硝酸盐后：结构变化、免疫反应及细胞凋亡

《Frontiers in Marine Science》：Nitrite exposure on gills of Oreochromis niloticus: structure change, immune response, and apoptosis

硝酸盐胁迫导致尼罗罗非鱼鳃组织学损伤、离子转运基因表达变化、抗氧化酶活性失衡及IL-17信号通路激活，同时引发线粒体结构损伤和细胞凋亡。

　　在高密度水产养殖系统中，亚硝酸盐是一种常见的污染物，其对鱼类健康的潜在影响不容忽视。作为直接接触环境的器官，鳃在鱼类生理功能中扮演着关键角色，不仅负责气体交换，还参与渗透压调节和黏膜免疫反应。本研究通过一系列亚硝酸盐浓度梯度实验，探讨了其对罗非鱼鳃的影响，特别是免疫反应方面的变化。研究结果表明，亚硝酸盐暴露会显著增加鳃上皮中的黏液细胞数量，并改变氯细胞的亚型分布。此外，亚硝酸盐暴露显著提升了血清中的过氧化氢酶（CAT）活性，同时降低了超氧化物歧化酶（SOD）活性。在基因表达层面，亚硝酸盐处理后，钠/氯共转运蛋白（ncc）的表达显著上调，而炎症相关基因的表达也发生了明显变化。通过体外和体内实验发现，关键的IL-17信号通路基因在亚硝酸盐暴露后表现出显著的表达变化。同时，鳃组织中线粒体的结构损伤和细胞凋亡现象也被观察到。本研究结果揭示了亚硝酸盐如何通过改变免疫功能和离子运输机制，特别是激活IL-17信号通路、造成线粒体结构损伤和鳃组织细胞凋亡，进而对鱼类健康产生不利影响。

### 亚硝酸盐的来源与危害

亚硝酸盐在水体环境中通常作为氨氮硝化过程中的中间产物，以及硝酸盐脱氮过程中的副产物而存在。正常情况下，水体中的亚硝酸盐浓度较低，但多种因素可能导致其积累，包括水体中浮游植物数量不足、氨化菌与硝化菌之间的平衡被打破，以及溶解氧含量偏低，抑制了完整的硝化作用并促进了脱氮反应。因此，在复杂的水体环境中，亚硝酸盐浓度往往超过监管标准。在管理不当的过度投喂水产养殖中，亚硝酸盐浓度甚至可能高达50 mg/L。此外，水体中的紫外线会促进水体分解和含氮基团的活化，导致相同浓度的亚硝酸盐在自然水体环境中可能表现出更高的毒性。在亚硝酸盐浓度升高的水体中，其会在鱼的不同组织中富集，包括血清、鳃、肝脏和肌肉。

### 亚硝酸盐对鱼类生理功能的影响

亚硝酸盐对鱼类的多种生理功能具有显著影响。首先，它会破坏鳃的结构完整性。例如，在急性亚硝酸盐暴露下，草鱼的鳃丝会出现肿胀、次级鳃小叶融合和增生等病理变化。类似地，另一种鱼类在暴露于48小时的急性亚硝酸盐条件下，次级鳃小叶也会发生扭曲、缩小和组织紊乱。这些现象表明，亚硝酸盐对鳃的结构具有直接的破坏作用。

其次，亚硝酸盐会干扰鱼类鳃中的离子运输机制。在草鱼中，亚硝酸盐显著提高了细胞外钾离子的浓度，其进入鳃的过程与氯离子竞争使用相同的离子通道蛋白。这种竞争会导致功能性血红蛋白转化为高铁血红蛋白，从而降低其氧气结合能力。同样，在鲤鱼中，亚硝酸盐暴露也会导致动脉血氧水平下降至与环境氧含量相当，造成代谢失衡。这些发现表明，亚硝酸盐不仅影响鳃的结构，还可能通过干扰离子平衡和氧气运输机制，影响鱼类的生存能力。

此外，鳃是鱼类重要的黏膜免疫组织之一，其上皮细胞能够激活多种先天和适应性免疫反应，为鱼类提供免疫保护。先天免疫依赖于抗菌肽、细胞因子和干扰素，而适应性免疫则主要由B细胞和T细胞介导。在某些鱼类中，亚硝酸盐暴露会显著降低溶菌酶水平，同时增加免疫球蛋白的表达，这表明其对鳃免疫功能产生了影响。在另一种鱼类中，亚硝酸盐暴露导致促炎因子如肿瘤坏死因子α（tnf-α）、白细胞介素6（il-6）和白细胞介素12（il-12）的表达显著增加，进一步说明了亚硝酸盐对鱼类免疫系统的干扰。

### IL-17信号通路的激活与免疫反应

IL-17是一类古老的促炎细胞因子，在宿主防御微生物感染和调控炎症反应中起着至关重要的作用。IL-17通过激活关键的信号分子，如NF-κB、MAPK和C/EBP，来启动免疫反应或促进细胞增殖。在鱼类中，鳃作为黏膜免疫和屏障器官，其IL-17信号通路的激活可能有助于增强黏膜屏障功能并提高对病原体的防御能力。研究表明，IL-17信号通路在调节慢性炎症和免疫反应方面具有重要作用，同时也在细胞和系统代谢调控中发挥关键作用。例如，在某些鱼类中，暴露于氨氮时，其鳃组织中IL-17信号通路相关基因和蛋白的表达显著升高。而在感染某些病原菌的鱼类中，IL-17相关基因如il-17c及其受体的表达也显著上调。这些结果表明，IL-17信号通路在鱼类免疫反应中具有重要作用，但目前对于亚硝酸盐暴露下该通路的具体作用机制仍存在研究空白。

在本研究中，我们通过体外和体内实验观察到，亚硝酸盐暴露显著改变了IL-17信号通路中关键基因的表达。例如，在体外实验中，鳃细胞暴露于60 mg/L亚硝酸盐3至6小时后，mapk和il-1β的表达显著上调，而fosb的表达则显著下调。值得注意的是，il17ra（IL-17受体）的表达也显著增加。在体内实验中，暴露于60 mg/L亚硝酸盐7天后，traf4a和mapk的表达显著上调，而fosb的表达显著下调，同时il-1β和il17ra的表达也显著增加。这些结果表明，亚硝酸盐暴露能够激活IL-17信号通路，并且这种激活可能通过上调下游炎症因子的表达，如il-1β，从而增强鳃的黏膜免疫保护功能。

IL-17信号通路的激活还可能与鱼类的适应性免疫反应有关。例如，IL-17能够促进T细胞向Th17细胞分化，而Th17细胞在对抗病原微生物和维持免疫稳态方面具有重要作用。然而，某些基因如fosb的表达却呈现出下调趋势，这可能与反馈调节机制有关。fosb编码的蛋白可以与JUN家族蛋白形成AP-1转录因子复合物，而AP-1的活性可能在长期亚硝酸盐暴露下受到抑制，从而影响IL-17信号通路的正常功能。同时，traf4a作为IL-17信号通路的负调控因子，其表达的显著增加可能有助于防止过度的炎症反应，维持免疫平衡。

### 线粒体损伤与细胞凋亡

除了对免疫和离子运输的影响，亚硝酸盐还可能对鳃组织中的线粒体结构造成损害。通过透射电子显微镜（TEM）观察发现，暴露于60 mg/L亚硝酸盐7天后，鳃线粒体的内膜嵴出现断裂、点状结构和组织紊乱，这与对照组的正常线粒体结构形成鲜明对比。这些现象表明，亚硝酸盐可能通过破坏线粒体功能，进而影响鳃细胞的能量代谢和生理稳态。

同时，亚硝酸盐暴露还引发了鳃组织中的细胞凋亡现象。通过TUNEL凋亡检测发现，暴露于60 mg/L亚硝酸盐7天后，鳃丝末端的间鳃区域出现了大量荧光标记的凋亡细胞，这表明亚硝酸盐对鳃细胞具有促凋亡作用。类似的研究也表明，在急性亚硝酸盐暴露下，某些鱼类的凋亡相关基因如caspase-3、caspase-8、caspase-9和p53的表达显著增加，而抗凋亡基因如Bcl-2的表达则显著减少。这些结果进一步支持了亚硝酸盐对鳃细胞的毒性作用，并提示其可能通过诱导凋亡来破坏鳃组织的完整性。

尽管本研究观察到了亚硝酸盐暴露引起的线粒体损伤和细胞凋亡，但尚未深入探讨这两者之间的潜在联系。未来的研究可以进一步分析亚硝酸盐如何通过影响线粒体功能，进而引发细胞凋亡，以及这些过程在鱼类免疫和生理稳态中的具体作用。

### 研究意义与未来方向

综上所述，本研究首次揭示了亚硝酸盐暴露对鱼类鳃组织的影响，特别是在免疫功能和离子运输机制方面的变化。亚硝酸盐不仅改变了黏液细胞的数量和氯细胞的亚型分布，还通过激活IL-17信号通路，促进了炎症反应，并导致线粒体结构损伤和细胞凋亡。这些发现不仅加深了我们对亚硝酸盐如何影响鳃组织功能的理解，也为水产养殖中控制亚硝酸盐污染提供了新的视角。

然而，本研究仍存在一些局限性。例如，虽然我们观察到了亚硝酸盐对离子浓度和氧化应激指标的影响，但并未评估鱼类血清中的离子水平和渗透压变化。此外，我们尚未深入探讨IL-17信号通路中某些关键基因表达变化的分子机制，特别是fosb的下调是否与AP-1活性的变化有关。同时，线粒体损伤和细胞凋亡之间的关系也需进一步研究。

未来的研究可以进一步探讨亚硝酸盐暴露对鱼类其他组织的影响，以及其在不同鱼类中的毒性差异。此外，通过结合蛋白质组学和代谢组学分析，可以更全面地了解亚硝酸盐对鱼类生理功能的调控机制。这些研究不仅有助于揭示亚硝酸盐的毒性机制，还可能为改善水产养殖环境、提高鱼类健康水平提供科学依据。