使用E2-CD154蛋白和STING激动剂c-di-AMP进行舌下免疫，可以保护猪免受经典猪瘟病毒的侵害

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Sublingual immunization with E2-CD154 protein and the STING agonist c-di-AMP confers protection against classical swine fever virus in pigs

本研究评估了E2-CD154蛋白与c-di-AMP黏膜佐剂联合亚lingual免疫对猪古典 swine瘟（CSF）的保护效力。实验表明，该组合能显著抑制病毒复制，诱导系统IgG和IgA抗体及中和抗体，临床保护效果与商业疫苗相当，且通过降低血清IFN-α水平减少先天免疫激活，为黏膜递送非复制性DIVA兼容疫苗提供了新思路。

　　本研究聚焦于一种新型的黏膜亚单位疫苗，旨在探索其在猪群中对经典猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus, CSFV）的免疫原性和保护效果。作为一类相对安全的疫苗类型，亚单位疫苗通过选择特定病原体的抗原成分来激发免疫应答，避免了活疫苗可能带来的潜在风险。然而，这类疫苗通常需要强有力的佐剂来增强免疫反应，尤其是在应对高度传染性疾病如经典猪瘟时。研究团队采用了一种创新的策略，将CSFV的E2糖蛋白与猪CD154分子融合形成E2-CD154嵌合蛋白，并与一种新型黏膜佐剂c-di-AMP共同使用，通过舌下途径进行免疫。这种组合不仅在猪群中展现出良好的免疫效果，还有效限制了病毒的复制和传播，其保护效果与目前市场上广泛应用的肌内注射疫苗Porvac?相当，为开发新型疫苗平台提供了重要的科学依据。

### 疫苗的免疫机制与优势

经典猪瘟是一种具有高度传染性的出血性疾病，对全球的养猪业构成严重威胁。CSFV属于黄病毒科的猪瘟病毒属，是一种包膜RNA病毒，其感染通常会导致高死亡率和严重的经济损失。由于其传播能力强，控制该病的关键在于开发有效的疫苗策略。Porvac?作为一种商业化的亚单位疫苗，基于E2-CD154嵌合蛋白，通过肌内注射方式实现保护，具有良好的DIVA（区分免疫与自然感染）特性，使得疫苗接种的动物可以与自然感染的动物区分开来，这对疾病监测和防控具有重要意义。

然而，传统的肌内注射方式存在一定的局限性，例如需要多次接种、使用针头可能带来不适感以及不适合大规模野生动物免疫等。因此，探索更加安全、便捷的免疫途径成为疫苗研发的重要方向。舌下途径作为一种非侵入性、易于操作的黏膜免疫方式，能够直接作用于黏膜免疫系统，同时避免了胃肠道中可能对疫苗成分的降解。此外，这种途径不需要注射，能够提高动物的接受度，减少疫苗接种带来的应激反应，尤其适用于大型哺乳动物如猪的免疫。

研究团队选择c-di-AMP作为黏膜佐剂，这是近年来发现的一种具有免疫刺激作用的分子，最初在芽孢杆菌中被识别为第二信使，其能够激活STING（干扰素基因刺激蛋白）通路，从而增强宿主的先天免疫反应。在小鼠模型中，c-di-AMP已被证实可以有效促进局部和全身的体液免疫应答，同时诱导对多种病原体的保护。本研究首次在猪这一大型哺乳动物中评估了c-di-AMP作为黏膜佐剂的潜力，结果表明其与E2-CD154嵌合蛋白联合使用，能够显著增强疫苗的免疫原性，从而提供有效的保护。

### 免疫效果的评估与比较

为了评估E2-CD154与c-di-AMP联合使用的免疫效果，研究团队设计了多个实验，包括不同剂量和免疫频率的优化实验，以及对疫苗保护效果的验证实验。在剂量优化实验中，研究人员比较了低剂量组（100 μg E2-CD154 + 50 μg c-di-AMP）和高剂量组（500 μg E2-CD154 + 500 μg c-di-AMP）的免疫反应。结果显示，高剂量组的猪在接种后第34天表现出显著的抗CSFV E2抗体反应，而低剂量组未能达到足够的抗体水平。这表明，增加E2-CD154和c-di-AMP的剂量有助于提升免疫效果。

在免疫频率的优化实验中，研究人员分别采用三剂和九剂接种方案。结果显示，九剂接种方案的免疫效果更为显著，不仅在第21天和第37天检测到了抗体反应，而且抗体水平显著高于对照组。这表明，频繁的免疫刺激能够进一步增强疫苗的免疫原性，从而提高保护效果。在后续的保护效果验证实验中，所有接种E2-CD154与c-di-AMP的猪在接种后第35天被挑战感染，结果显示，三只猪完全未表现出临床症状，而另外两只仅出现短暂的轻度症状后迅速恢复。相比之下，仅接种E2-CD154的猪则出现了明显的临床症状，包括发热、嗜睡、呼吸困难等，且部分动物因病情严重而被安乐死。这进一步验证了c-di-AMP作为黏膜佐剂在提升疫苗保护效果方面的关键作用。

### 免疫应答的全面分析

除了临床保护效果外，研究还深入分析了疫苗诱导的免疫应答类型，包括体液免疫和细胞免疫。在体液免疫方面，研究人员通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了猪体内针对CSFV E2和E^rns糖蛋白的抗体水平。结果显示，接种E2-CD154与c-di-AMP的猪体内检测到了显著的抗E2抗体，其阻断百分比达到70%以上，而仅接种E2-CD154的猪则表现出较弱的抗体反应。此外，所有接种疫苗的猪体内均未检测到抗E^rns抗体，进一步支持了E2-CD154作为DIVA疫苗的潜力。

在细胞免疫方面，尽管本研究未直接检测T细胞介导的免疫反应，但通过分析IFN-α水平可以间接评估疫苗对先天免疫系统的影响。结果显示，接种E2-CD154与c-di-AMP的猪在感染后表现出极低的IFN-α水平，而仅接种E2-CD154的猪和对照组则出现了显著的IFN-α升高。IFN-α通常与病毒感染后的免疫激活相关，其水平的升高可能预示着病毒复制的增强。因此，接种E2-CD154与c-di-AMP的猪在感染后表现出更弱的先天免疫反应，这可能与其对病毒复制的抑制作用有关。

此外，研究人员还检测了疫苗诱导的IgG和IgA抗体应答。结果显示，接种E2-CD154与c-di-AMP的猪在感染后表现出显著的IgG和IgA反应，其抗体水平与Porvac?疫苗相当。IgG抗体主要作用于体液免疫，而IgA抗体则在黏膜免疫中发挥重要作用。因此，这种疫苗不仅能够提供全身性的免疫保护，还能够有效增强黏膜免疫应答，从而限制病毒在体内的扩散。

### 病毒检测与免疫效果的验证

为了进一步验证疫苗的保护效果，研究人员对所有接种动物进行了病毒检测，包括病毒RNA的检测和病毒分离实验。结果显示，接种E2-CD154与c-di-AMP的猪在感染后，其血清、口腔拭子和直肠拭子中均未检测到CSFV RNA，而仅接种E2-CD154的猪和对照组则表现出较高的病毒RNA载量。值得注意的是，尽管某些接种疫苗的猪体内检测到了病毒RNA，但这些RNA无法分离出具有感染性的病毒，表明疫苗有效抑制了病毒的复制和传播。

此外，研究人员还检测了疫苗对病毒传播的限制效果。所有接种E2-CD154与c-di-AMP的猪在感染后，其扁桃体样本中均未检测到可分离的病毒，而仅接种E2-CD154的猪和对照组则表现出较高的病毒载量。这表明，c-di-AMP不仅增强了疫苗的免疫原性，还有效限制了病毒在黏膜组织中的复制，从而降低了病毒传播的风险。

### 研究的意义与未来方向

本研究的结果为开发一种非复制型、DIVA兼容的黏膜疫苗平台提供了重要的科学依据。通过将E2-CD154嵌合蛋白与c-di-AMP联合使用，研究人员成功实现了对CSFV的有效保护，其保护效果与传统的肌内注射疫苗相当。这种策略不仅提高了疫苗的安全性，还增强了其在黏膜免疫中的应用潜力，为未来的疫苗研发提供了新的思路。

未来的研究将致力于优化疫苗的接种方案，包括减少接种次数、探索口服途径等，以提高疫苗的实用性。此外，研究团队还计划进一步分析T细胞介导的免疫反应，以全面了解疫苗的作用机制。由于黏膜免疫在预防呼吸道和消化道传染病中具有重要作用，这种策略有望在多种哺乳动物中推广，包括人类。因此，本研究不仅对经典猪瘟的防控具有重要意义，也为其他病毒性疾病的疫苗开发提供了参考。