从循环结构到帽子结构：利用5-呋喃基-2′-脱氧尿苷荧光探针区分不同G-四聚体上的肽结合

《RSC Chemical Biology》：From loops to caps: discriminating peptide binding to distinct G-quadruplex tetrads using 5-furyl-2′-deoxyuridine fluorescent probes

荧光探针5FU用于区分G4四联体配体结合位点及亲和力研究。通过将5FU特异性标记到T95-2T和c-KIT2的G4终端四联体，结合荧光强度变化与NMR结构分析，发现肽类配体RHAU23优先结合5'端四联体（Kd=0.33±0.02 μM），而小分子配体如BRACO-19则通过π-堆积或插入作用导致荧光淬灭。研究证实5FU探针能有效区分G4四联体特异性，并建立Kd定量分析方法。

　　本研究探讨了如何利用5-呋喃基-2′-脱氧尿苷（5FU）作为荧光探针，以区分不同配体对G-四链体（G4）的结合偏好。通过在特定位置将5FU引入T95-2T序列的帽区，我们能够通过荧光增强的方式识别肽配体的结合事件，从而揭示配体与G4结构中不同四链体之间的相互作用特性。这一方法基于5FU在不同环境下的荧光响应特性，当其处于受限或粘稠环境中时，荧光强度会显著增加，而当处于自由旋转的环境中时，荧光则会减弱。因此，通过监测荧光变化，我们可以判断配体是否改变了5FU的局部环境，从而推断其与G4结构的结合方式。

G-四链体是由富含鸟嘌呤的核酸序列折叠形成的非典型二级结构，近年来被广泛研究，因为它们在多种生物学过程中发挥重要作用，包括转录调控、端粒维持以及RNA翻译等。这些特性使得G4成为药物研发的潜在靶点。为了研究G4与配体之间的相互作用，科学家们开发了多种方法，其中一种较为简便的方式是使用在特定位置修饰有荧光核碱基的寡核苷酸。5FU作为一种新型的荧光分子探针，最初由Tor团队开发用于检测双链DNA中的脱碱基位点。其荧光强度的变化与局部环境密切相关，尤其是在结构被固定或受到空间阻碍时，荧光会显著增强。这一特性使其成为研究G4结构变化和配体结合的理想工具。

在本研究中，我们选择了T95-2T G4序列与RNA解旋酶相关AU丰富元件（RHAU）肽作为模型系统。通过对已知结构的分析，我们发现当RHAU肽结合到G4结构时，原本位于帽区的脱氧胸苷（dT）基团会被移出到溶剂中，从而改变5FU的局部环境。这种环境的变化导致了荧光的增强，表明5FU的结合位置被从高度淬灭的区域转移到了更宽松的环境中。这一现象与之前关于5FU在G4结构中表现出的荧光增强机制一致，即当5FU与相邻的鸟嘌呤发生π-堆叠时，会受到较强的淬灭作用，而一旦被移出到更少鸟嘌呤的环境中，淬灭作用减弱，荧光强度随之增加。

我们进一步通过实验验证了这一假设。通过对T95-2T序列中不同位置的dT进行5FU修饰，我们构建了多个寡核苷酸变体，如ODN-1、ODN-2和ODN-6。这些变体在与RHAU肽结合后均表现出显著的荧光增强，其中ODN-2和ODN-6的增强幅度较大，而ODN-1的增强则相对较小。这一差异可能与5FU在不同四链体上的结合方式有关，例如ODN-2和ODN-6中的5FU仅部分与四链体发生π-堆叠，而ODN-1中的5FU则完全位于帽区，受到更多鸟嘌呤的淬灭作用。此外，我们还观察到荧光发射峰的轻微红移，这进一步支持了5FU在结合后被移出到更溶剂暴露和极性更强的环境中的假设。

为了进一步验证这一机制，我们还测试了其他已知的小分子G4配体，如BRACO-19、TMPyP4和Phen-DC3。这些配体通常通过π-堆叠的方式与G4结构结合，因此它们的结合行为与RHAU肽有所不同。在与ODN-2结合时，这些小分子配体导致了荧光的逐渐减弱，甚至出现荧光淬灭现象，这与我们观察到的RHAU肽引起的荧光增强形成鲜明对比。这一结果表明，不同类型的配体可能对5FU的荧光响应产生不同的影响，尤其是在结合方式和对四链体结构的扰动程度方面。

此外，我们还研究了双标记的ODN-8，该探针在5′和3′端均引入了5FU。荧光滴定实验显示，RHAU肽的结合首先影响5′端的四链体，随后才作用于3′端。这一结果与NMR结构数据一致，表明RHAU肽对5′端的亲和力更强。我们还利用c-KIT G4结构进行了类似的实验，发现RHAU肽对3′端的亲和力更高，这可能与该结构中帽区的构型有关。这一发现进一步说明了5FU探针在区分不同四链体结合偏好方面的潜力。

为了验证该方法在复杂环境中的适用性，我们还在分子拥挤条件下（如加入20% PEG600）对ODN-8进行了荧光滴定实验。结果显示，在这种模拟细胞环境的条件下，5FU探针仍然能够有效监测RHAU肽的结合行为，并且荧光强度显著增强。这表明，该方法不仅适用于简单的寡核苷酸系统，还能够适应更接近实际生物环境的条件，从而为研究G4结构与配体之间的相互作用提供了新的思路。

通过这一研究，我们发现5FU探针在监测G4结构中不同四链体的结合偏好方面具有显著优势。其荧光响应能够提供关于配体结合方式和结合强度的定性信息，而这些信息在某些情况下可以作为高分辨率结构技术的有力补充。此外，该方法还具有操作简便、成本较低的特点，使其成为研究G4结构与配体相互作用的实用工具。未来，我们计划开发具有不同荧光特性（如不同激发和发射波长）的5FU类似物，以实现对G4结构中两个不同四链体的独立和同时监测，从而提高研究的精度。同时，我们也希望将这一方法拓展到研究G4-RNA结构以及其他更复杂的蛋白质-核酸相互作用体系中，以进一步探索G4在生物学中的多样功能。