利用环境DNA来优化濒危内陆海豹（Phoca vitulina mellonae）的分布图谱，并确认其系统发育关系

《Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences》：Refining the distribution and confirming the phylogenetic relationship of the endangered landlocked harbour seal Phoca vitulina mellonae using environmental DNA

本研究利用环境DNA技术，结合探针式qPCR和代谢条形码方法，分析了加拿大努纳维克地区北极湖海豹Phoca vitulina mellonae的分布及线粒体遗传多样性。结果表明，eDNA检测覆盖了五个水域，证实了该亚种在关键栖息地和潜在栖息地的存在，并揭示了采样体积、月份和与海豹的距离对DNA检测的影响。mtDNA分析进一步确认了该亚种在全球海豹多样性中的独特地位，为濒危物种监测提供了有效工具。

　　本研究聚焦于一种濒危的淡水海豹亚种——加拿大魁北克北部的“Nuuchimii-achikw”海豹（学名：*Phoca vitulina mellonae*），其栖息地覆盖了一个约700平方公里的亚北极湖泊生态系统。这一亚种的数量估计在50至600只之间，是全球范围内分布最为局限的海豹之一。为了更好地了解该物种的分布情况和遗传多样性，研究人员自2019年起采用了一种名为环境DNA（eDNA）的非侵入性监测技术。通过构建一个广泛的采样网络，结合定量PCR（qPCR）和宏条形码技术，研究人员不仅提高了对这一濒危物种的监测能力，还为制定更有效的保护策略提供了科学依据。

### 研究背景与意义

对于濒危物种的保护而言，准确掌握其分布情况是优化保护措施的关键。传统方法如船只或飞机调查、被动声学监测和卫星遥感等虽然在一定程度上提供了物种分布信息，但这些方法往往成本高昂且存在较高的不确定性，特别是在个体数量稀少、活动范围广泛或栖息地难以进入的物种上。例如，飞机调查可能无法检测到长时间潜伏水下的稀有个体，从而导致对其存在和数量的低估。因此，寻找一种更加高效、低成本且非侵入性的监测手段成为研究的重点。

eDNA技术为这一问题提供了新的解决方案。eDNA指的是从环境中采集的DNA，无需直接接触生物个体即可进行检测。这种方法的敏感性使其成为监测稀有物种的理想工具。研究发现，目前开发的eDNA检测方法在北美地区的检测限为每qPCR反应0.4个拷贝（95%置信区间：0.3-0.8），而本研究开发的qPCR方法检测限为0.2个拷贝，具有更高的灵敏度。此外，通过宏条形码技术，研究人员能够对eDNA样本中的线粒体DNA（mtDNA）多样性进行分析，为物种的遗传结构和演化历史提供了新的视角。

### 采样网络与技术方法

研究团队在魁北克北部的Nunavik地区构建了一个跨学科的采样网络，包括来自地方政府、原住民社区和科研机构的参与者。这些采样点分布在五个不同的流域内，其中一些是通过公路无法抵达的偏远区域。为了克服这些地理限制，研究人员采用了多种采样策略，包括直升机采样和岸边采样。直升机采样时，使用8磅重的重物将水瓶沉入水中，以获取表层水样。岸边采样则直接在水体表面采集样本。所有采样人员在采样前都会接受严格的消毒和操作培训，以减少污染风险。

在实验室处理过程中，所有样本均在专门的eDNA洁净实验室中进行处理，以确保检测的准确性。所有实验材料和样本容器在进入实验区前均需经过10%次氯酸钠溶液的消毒处理。为了进一步提高检测效率，研究人员对PCR条件进行了优化，并使用了不同类型的反应混合物。通过这些方法，他们成功地从多个水体中检测到了*Phoca vitulina mellonae*的DNA，包括被认为是关键栖息地的湖泊以及潜在栖息地的河流。

### eDNA检测结果与分析

研究结果显示，eDNA检测不仅限于已知的关键栖息地，还发现该物种在一些水体中存在，这些水体原本未被纳入关键栖息地的范围。这一发现对保护政策的制定具有重要意义，因为它表明需要重新评估该物种的分布范围，并扩大保护区域。此外，eDNA拷贝数的估计受到采样月份和水体体积的影响，同时与采样点与海豹之间的距离呈负相关。这意味着，在海豹活动频繁的季节（如春季）和较大的水体中，eDNA的浓度更高，检测结果也更可靠。

为了进一步验证这些发现，研究团队采用了统计模型，分析了不同采样参数对eDNA检测的影响。结果表明，采样体积越大，检测到eDNA的可能性越高。同时，春季的采样效果优于其他季节，这可能与海豹的繁殖和换毛行为有关。这些发现不仅为eDNA技术的应用提供了重要参考，也为未来优化采样策略提供了依据。

### mtDNA多样性分析

通过宏条形码技术，研究人员对*Phoca vitulina mellonae*的mtDNA多样性进行了深入分析。结果显示，该亚种的线粒体DNA序列与其他*Phoca vitulina*亚种相比具有显著的差异，表明其在物种演化过程中形成了独特的遗传群体。这些序列与历史组织样本中的序列相似，进一步验证了该亚种的遗传独特性。

在构建的系统发育树中，*Phoca vitulina mellonae*的序列被归入一个独立的分支，与大西洋和太平洋的其他*Phoca vitulina*亚种形成明显分离。这一结果支持了该亚种长期孤立演化的假说，即它在大约3000至8000年前因冰川退缩而与海洋种群分离，形成了一个独特的淡水种群。此外，研究还发现，该亚种的mtDNA多样性水平较低，这可能是由于其种群规模较小和遗传漂变等因素造成的。

### 技术应用与挑战

尽管eDNA技术在监测稀有物种方面展现出巨大潜力，但其应用仍面临一些挑战。例如，DNA片段的长度对检测效率有显著影响。本研究中，qPCR方法使用的DNA片段较短（65个碱基对），而宏条形码方法使用的片段较长（309个碱基对），导致后者检测率较低。这种差异可能与DNA在环境中的降解速率有关，较长的DNA片段更容易受到环境因素的影响而消失。

此外，部分样本中出现了PCR抑制现象，这可能是由于样本中的某些物质（如有机物或金属离子）干扰了PCR反应。为了克服这一问题，研究人员建议未来可以尝试使用不同的PCR主混合物，以减少抑制的影响。然而，由于样本中DNA浓度普遍较低，抑制去除过程可能导致DNA损失，因此需要在灵敏度和抑制控制之间找到平衡。

### 未来展望与保护意义

本研究的成功为未来在偏远地区监测濒危物种提供了宝贵的经验。通过构建一个广泛的采样网络，研究人员不仅克服了地理上的障碍，还提高了对物种分布的了解。这种非侵入性的方法不仅降低了监测成本，还减少了对生物个体的干扰，符合现代生态保护的伦理要求。此外，eDNA技术的广泛应用有助于提高对稀有物种的监测效率，特别是在那些传统方法难以覆盖的区域。

然而，研究也指出了一些局限性。例如，由于采样设计的不平衡性（即某些水体采样次数较少，采样时间分布不均），部分结论的可靠性受到一定影响。未来的研究应进一步优化采样策略，特别是在Lac Minto和Lac Bienville流域增加采样频率，以更全面地了解该物种的遗传多样性。同时，对于Lac Wiyashakim?和Lac Amichinatwayach等尚未进行采样的水体，也需要更多的调查，以确认该物种是否在这些区域有分布。

总之，这项研究不仅为*Phoca vitulina mellonae*的保护提供了新的数据支持，还展示了eDNA技术在监测濒危物种方面的巨大潜力。通过与原住民社区和地方政府的合作，研究人员能够有效利用当地的知识和资源，提高采样效率和数据的可靠性。未来，随着技术的不断进步和采样方法的优化，eDNA有望成为监测和保护稀有物种的重要工具，为全球范围内的生物多样性保护做出更大贡献。