布鲁氏锥虫（Trypanosoma brucei）变异表面糖蛋白3′非翻译区中16聚体基序的双重作用

《Molecular Microbiology》：The Dual Role of the 16mer Motif Within the 3′ Untranslated Region of the Variant Surface Glycoprotein of Trypanosoma brucei

VSG的16mer保守序列在转录开关中起关键作用，突变不影响基础表达和细胞存活，但降低异源VSG的开关效率。

　　非洲锥虫（*Trypanosoma brucei*）是一种单细胞原生动物寄生虫，具有重要的医学和兽医意义。该寄生虫在哺乳动物宿主的血液和组织液中生存，尽管暴露在宿主的免疫系统之下。感染通常可以持续数月甚至数年，这种长期感染的能力归因于其通过抗原变异（antigenic variation）不断改变其表面被膜蛋白（variant surface glycoprotein, VSG）的特性。VSG是锥虫表面的主要成分，由超过2000种不同的VSG同种异型组成，每个细胞仅表达其中一种。VSG的表达主要依赖于特定的表达位点（expression site, ES），每个ES都包含一个转录复合体，称为表达位点体（expression site body, ESB）。在细胞内，只有单一的ES处于活跃状态，其他ES则处于沉默状态，这种现象称为“等位基因排除”（allelic exclusion），确保了VSG的单克隆表达。

VSG在寄生虫生命周期中的重要性不言而喻，其在哺乳动物阶段的总蛋白中占比高达10%，并且VSG mRNA是血流型锥虫中最为丰富的mRNA之一，其半衰期可达1至4.5小时。这种高稳定性与高表达水平被认为是RNA聚合酶I（RNA pol-I）转录和后转录调控机制共同作用的结果。锥虫的基因组以长多顺反子转录单元（polycistronic transcription units）的形式组织，大部分基因在这些转录单元中被连续转录，随后通过一种耦合的转录后加工过程（包括转录后剪接和多聚腺苷酸化）被切割为单独的mRNA。因此，基因表达的调控在锥虫中主要发生在转录后阶段，而3’非翻译区（UTR）中的调控序列，尤其是3’UTR中的顺式调控元件（cis-regulatory elements），在调节mRNA稳定性与翻译效率方面发挥着关键作用。

在VSG基因的3’UTR中，两个高度保守的顺式调控元件，即8mer和16mer，被发现与VSG表达的后转录调控有关。其中，16mer被证实对于VSG mRNA的稳定性至关重要。然而，令人困惑的是，16mer在所有转录和非转录的VSG基因中均保持100%的保守性，这在调控序列中是非常罕见的现象。这种高度保守性可能暗示着16mer除了稳定mRNA外，还承担着其他关键功能。本研究旨在探讨16mer在VSG表达调控中的多重作用，特别是其是否在抗原变异过程中起着关键作用。

研究结果表明，16mer的100%保守性并非维持VSG蛋白功能表达所必需。即使在16mer发生突变的情况下，细胞仍能维持高表达的VSG蛋白水平，说明这种突变对细胞存活无显著影响。此外，16mer在表达位点中并不影响VSG的沉默过程，也不影响锥虫从血流型向procyclic型（昆虫阶段）的分化。然而，当在非表达位点中引入一个带有16mer突变的VSG基因时，其引发VSG沉默和表面被膜更换的效率显著降低。这表明，16mer在表达位点中可能并非必需，但在非表达位点中却起着至关重要的作用。这种不对称的调控机制可能反映了VSG沉默与表面被膜替换过程中的不同调控路径。

进一步的实验表明，即使在表达位点中存在16mer的突变，其对VSG沉默的效率影响并不明显。然而，当使用带有突变16mer的VSG进行过表达时，尤其是通过模拟原位VSG切换（in situ switching）的方式，这种突变会显著降低VSG沉默的效率。这说明，16mer在原位切换过程中可能起到关键作用，而不仅仅是维持mRNA的稳定性。这一发现支持了16mer在VSG表达调控中的双重角色：一方面，它通过影响mRNA稳定性维持高表达水平；另一方面，它在VSG切换过程中可能参与调控沉默机制。

此外，研究还探讨了16mer在mRNA稳定性中的具体机制。虽然有研究提出16mer可能通过N6-甲基腺苷（m6A）修饰来稳定VSG mRNA，但本研究显示，即使在16mer突变的情况下，m6A修饰仍然存在，说明该修饰并非16mer的必要条件。这表明，虽然16mer可能影响m6A的沉积，但其高度保守性可能更多与VSG切换过程中的其他调控机制相关。研究还发现，即使在16mer突变的情况下，VSG蛋白的表达仍能维持在较高水平，说明锥虫能够通过其他机制补偿16mer缺失带来的影响。

在实验过程中，研究者利用多种方法验证了这些结论。例如，通过构建带有不同突变的VSG基因，研究其在表达位点中的稳定性与沉默效率。此外，还通过RNA点印（RNA dot blot）和蛋白质点印（protein dot blot）等技术，量化了不同突变对VSG mRNA和蛋白水平的影响。结果表明，尽管16mer的突变会影响mRNA的丰度，但不会导致VSG蛋白的显著减少，因此不会影响细胞的生存能力。然而，突变会导致细胞生长速率下降，这可能与mRNA翻译效率降低有关。

在探索16mer在VSG切换中的作用时，研究者还发现，即使在表达位点中存在突变，VSG的沉默仍能正常进行。这表明，VSG的沉默可能主要依赖于其他调控机制，如转录抑制或染色质结构的改变。然而，当16mer位于非表达位点时，其对VSG切换的效率有显著影响，这可能意味着16mer在非表达位点中参与了调控VSG沉默的特定机制。这种机制可能涉及16mer与某些RNA结合蛋白（如CFB2）的相互作用，这些蛋白可能通过招募稳定复合体来促进VSG的表达。

综上所述，本研究揭示了16mer在VSG表达调控中的双重角色：一方面，它通过影响mRNA的稳定性维持高表达水平；另一方面，它在VSG切换过程中起着关键作用，特别是在非表达位点中。尽管16mer的突变不影响细胞的生存能力，但会显著影响VSG的表达和切换效率。这一发现不仅加深了我们对VSG表达调控机制的理解，还为抗原变异的研究提供了新的视角。未来的研究可以进一步探讨16mer在不同表达位点中的具体作用，以及其与其他调控元件之间的相互作用，从而揭示锥虫如何通过复杂的调控机制逃避宿主免疫系统的攻击。