针对转铁蛋白受体的顶端结构域：开发一种用于细胞递送的新蛋白质支架

《Protein Science》：Targeting the apical domain of the transferrin receptor: Development of a new protein scaffold for cellular delivery

转铁蛋白受体1（TfR）是铁代谢和多种病原体入侵的关键靶点，本研究通过计算蛋白设计结合定向进化策略，成功开发出靶向TfR apical域的小蛋白变体，验证其在体外和HeLa细胞中的结合能力，并优化至纳米摩尔级亲和力，为药物递送和抗病毒治疗提供新工具。

　　人类转铁蛋白受体1（TfR）在细胞铁平衡中起着关键作用，它通过内吞作用将铁载体蛋白转铁蛋白（Tf）和铁蛋白（ferritin）带入细胞内部。此外，TfR还被多种病原体利用作为细胞进入的途径，如由沙拉病毒引起的南美出血热和疟疾寄生虫 *Plasmodium vivax*。TfR在许多侵袭性癌症以及血脑屏障的内皮细胞中表达水平较高，这使其成为多种医疗应用的重要靶标。由于TfR在细胞生物学和疾病治疗中的重要性，科学家们一直在探索其新的蛋白质相互作用伙伴，以开发针对该受体的新型药物输送工具或抗病毒疗法。

为了实现这一目标，研究人员采用了一种计算辅助的蛋白质设计策略，旨在开发一种小型蛋白质，可用于跨细胞膜的药物输送、研究内吞作用机制、探索血脑屏障穿越能力，或阻止病原体对细胞顶端区域的入侵。设计的起点是基于计算对接的TfR顶端区域的小型蛋白质支架库，该区域是沙拉病毒Machupo病毒糖蛋白1（MGP1）的天然结合位点。通过对这些蛋白质支架的优化，研究团队筛选出最佳的候选物，并通过酵母表面展示系统（YSD）进行表达和评估。其中，一个最初显示较低结合信号的蛋白质变体经过定向进化优化后，能够以纳摩尔浓度与TfR结合。经过增强型绿色荧光蛋白（eGFP）标记并由细菌表达后，该蛋白质在细胞实验中表现出与荧光素异硫氰酸酯（FITC）偶联转铁蛋白相似的摄取能力，这表明其具备作为药物输送载体或抗病毒治疗基础的潜力。

TfR是一种结构复杂的膜结合蛋白，其由两个相同的亚基组成，总分子量约为170千道尔顿。TfR的结构主要由三个外源区域构成：顶端域、螺旋域和类蛋白酶域。除了Tf，TfR还能与一些内源性蛋白质相互作用，如铁调节蛋白HFE，该蛋白在螺旋域和类蛋白酶域部分重叠的结合位点上与TfR结合。铁载体蛋白铁蛋白也与TfR的顶端域结合。此外，TfR的顶端域还是某些病原体的结合位点，例如导致南美出血热的Machupo病毒糖蛋白1（MGP1）和疟疾寄生虫 *P. vivax* 的红细胞结合蛋白PvRBP2b，以及可能与狂犬病有关的蛋白。这些结合域的结构特点使得TfR成为多种蛋白质工程策略的靶点，例如针对顶端域的片状扩展设计和针对螺旋域的蛋白质结合器设计。

在过去的几十年中，蛋白质工程已经越来越多地依赖于计算方法。随着机器学习、计算能力提升、DNA合成技术的发展以及对结构-功能关系的深入理解，蛋白质设计变得更加高效。然而，设计具有新功能的蛋白质支架仍然是一个挑战，尤其是在计算上实现对小分子的结合、设计新的蛋白质-蛋白质相互作用或构建具有绝对结合自由能的蛋白质工程体系方面。准确计算短程和长程极性相互作用的复杂性，使得催化剂、结合器和蛋白质-蛋白质界面的设计面临困难。此外，蛋白质分子本身的灵活性和生物体内水分子的存在，也使得预测结合过程中的氢键形成、电荷-电荷相互作用和极性物种的脱溶剂化代价变得尤为困难。

计算蛋白质工程的优势在于能够针对特定的结合位点设计蛋白质。这种策略在非抗体衍生结合器的设计中尤其突出。通过不同的蛋白质支架拓扑结构和生物物理特性，如溶剂可及表面积（即大小）和电荷分布，可以探索多种结合特性。随着越来越多的结合器被开发出来，研究团队能够更有效地筛选出针对TfR的高效结合物。这些结合物不仅有助于揭示TfR介导的跨细胞膜转运机制，还可能在血脑屏障穿越和病原体进入抑制方面发挥重要作用。为了设计针对TfR顶端域的结合物，研究团队采用了计算方法，基于支架与目标蛋白的形状互补性和表面积，而非依赖于天然结合热点的已有知识。这种方法允许在不预先了解结合位点信息的情况下进行设计，并且能够选择特定的蛋白质拓扑结构，从而减少对天然结构的重新设计需求。这种方法与基于生成模型的机器学习方法形成对比，后者倾向于随机生成二级结构，并且往往偏向于高螺旋含量。

在TfR的结合设计过程中，研究团队首先筛选了约1000个小型蛋白质支架，这些支架来源于蛋白质数据库（PDB），并针对TfR的顶端域进行了计算对接。设计过程中，重点优化了结合界面的埋藏表面积（BSA）和形状互补性（SC）。经过两次优化，研究人员选择了最合适的变体TB14，并进一步进行了亲和力成熟。最终，TB14.2变体在实验中表现出显著的结合能力，并在细胞实验中显示出与FITC偶联转铁蛋白相似的摄取特性。为了进一步提高结合亲和力，研究团队进行了第二轮定向进化，生成了约100万种变体，并通过荧光激活细胞分选（FACS）进行筛选。在优化过程中，研究人员观察到结合信号随着TfR浓度的增加而增强，这表明设计的蛋白质能够有效地与TfR结合。

在实验验证阶段，研究团队利用酵母表面展示系统（YSD）对设计的蛋白质变体进行了评估，并通过流式细胞术和表面等离子共振（SPR）技术进一步确认了其与TfR的结合能力。这些实验不仅验证了蛋白质设计的有效性，还展示了其在细胞摄取和靶向应用中的潜力。研究人员还发现，某些变体在低浓度TfR下仍能表现出较强的结合能力，这表明其具有一定的亲和力。然而，随着结合能力的提升，某些变体的结合亲和力可能超过了实际应用的需求，例如在血脑屏障穿越过程中，过高的亲和力可能并不理想。因此，研究团队决定停止进一步的进化优化，以获得具有中等纳摩尔亲和力的结合物，这可能更符合实际医疗应用的需求。

此外，研究团队还探讨了TfR结合蛋白在不同实验条件下的表现。例如，在细胞摄取实验中，设计的蛋白质在HeLa细胞中表现出显著的荧光信号，这表明其能够有效进入细胞。在竞争实验中，研究人员发现，单独的TfR顶端域AP01能够显著降低设计蛋白质的结合信号，这进一步验证了其与TfR的特异性结合。这些实验结果表明，设计的蛋白质不仅能够与TfR结合，还能在细胞实验中表现出良好的靶向能力。

从方法学角度来看，研究团队采用了一系列先进的蛋白质工程技术，包括计算设计、定向进化、酵母表面展示、流式细胞术和表面等离子共振分析。这些方法的结合使得研究人员能够系统地优化蛋白质结合能力，并验证其在细胞中的功能。计算设计阶段，研究人员利用RosettaDock软件对蛋白质支架进行了对接优化，并通过RosettaScripts进行结合界面的残基设计。定向进化阶段，研究人员通过随机突变生成大量变体，并通过FACS筛选出结合能力最强的变体。这些筛选步骤不仅提高了蛋白质的结合亲和力，还确保了其在细胞实验中的稳定性。

在实验实施过程中，研究人员对设计的蛋白质进行了表达和纯化。通过将基因克隆到pETCON2载体中，并在大肠杆菌中表达，获得了具有eGFP标记的蛋白质变体。随后，利用尺寸排阻色谱（SEC）进一步纯化蛋白质，并通过SDS-PAGE验证其纯度。这些步骤确保了蛋白质在实验中的可靠性和一致性。

在最终的实验结果中，研究人员发现，设计的蛋白质在与TfR结合后，能够有效进入HeLa细胞，并表现出与天然转铁蛋白相似的摄取特性。这一发现为未来的药物输送系统和抗病毒疗法提供了重要的基础。此外，研究团队还发现，某些变体的结合亲和力显著优于天然转铁蛋白，这可能为开发更高效的药物载体提供了新的思路。然而，研究团队也指出，结合亲和力过强可能并不总是有益的，尤其是在血脑屏障穿越过程中，适当的结合亲和力可能更有利于药物的靶向释放和运输。

综上所述，这项研究通过计算设计和定向进化的方法，成功开发出一种能够特异性结合TfR顶端域的小型蛋白质。该蛋白质不仅在细胞实验中表现出良好的结合能力和摄取能力，还为未来的药物输送和抗病毒疗法提供了重要的工具。研究团队的成果表明，计算辅助的蛋白质工程策略在设计具有特定功能的蛋白质方面具有巨大潜力，并且能够在实际应用中实现有效的靶向结合。此外，这项研究也为理解TfR在细胞膜转运中的作用提供了新的视角，并可能推动相关疾病的治疗策略的发展。