集约化养殖系统原奶中抗性组、细菌组和移动基因组的宏基因组特征分析

《Journal of Advanced Research》：Metagenomic characterization of the resistome, bacteriome and mobilome in raw milk from intensive farming systems

抗生素耐药基因（ARGs）在山东 intensive dairy系统中的空间分布及跨物种转移机制研究，通过整合宏基因组测序与实验验证（包括细菌分离、抗生素敏感性测试、PCR检测、生物膜实验和接合实验），首次系统揭示了Klebsiella pneumoniae作为高风险载体介导的blaSHV基因跨物种转移，证实生物膜形成与β-内酰胺酶耐药性增强的正相关性，并提出基于精准干预的多技术协同防控策略。

　　在中国，随着奶业的快速发展，集约化养殖模式已成为全球奶业生产的主要方式。然而，这种高密度养殖和常规抗生素使用的模式也加剧了耐药基因（ARGs）的传播风险。抗生素耐药性不仅对畜牧业构成威胁，还可能通过食品链传播至人类，从而影响公共健康。本研究聚焦于中国山东省的42个集约化奶牛场，通过整合宏基因组测序与实验验证方法，分析了539个样本（包括生乳、牧草、水源和乳房拭子）中ARGs的时空传播模式，并探讨了耐药基因在高风险病原体如肺炎克雷伯菌（*Klebsiella pneumoniae*）中的共进化规律，以及生物膜对耐药性增强的影响，同时揭示了bla_SHV基因通过质粒介导的跨物种传播机制。

在研究背景中，全球奶业产量在2023年达到了8.6亿吨，比2010年增长了24%。中国作为世界第二大奶业生产国，每年产量约为4197万吨。然而，集约化奶业也带来了抗生素耐药性的严重问题。根据世界卫生组织（WHO）的数据，未经巴氏杀菌的生乳中携带致病菌的概率是工业加工乳制品的150倍以上，而某些地区商业生乳中志贺毒素产生大肠杆菌（STEC）的检出率高达47.16%。这表明，生乳不仅是营养来源，也可能是抗生素耐药性传播的重要媒介。此外，中国某些奶牛场中β-内酰胺类抗生素的预防性使用量超过了欧盟标准的2-3倍，而多重耐药菌（MDR）的检出率也在逐年上升。这种“生产-污染”的恶性循环不仅威胁消费者的健康，还加速了耐药基因向人类病原体的传播，形成了难以控制的耐药基因库。

本研究首次构建了一个覆盖奶业全产业链的耐药基因传播分析框架，结合宏基因组测序和实验验证技术，全面解析了耐药基因在不同区域和不同样本类型中的分布特征。通过多组学分析，研究发现山东不同地区中，东营（DY）地区的生乳中微生物多样性最高（16,347种），ARGs的丰度也最高（547个亚型），其中β-内酰胺酶基因占主导地位（56.3%）。相比之下，青岛（QD）地区的微生物丰度和多样性最低，其ARGs亚型数量仅为250个，远低于DY的396个。这种差异可能与地理和环境因素密切相关，例如DY位于黄河三角洲，土壤中某些重金属的积累可能通过激活微生物的应激反应途径，间接促进ARGs的富集。此外，集约化养殖模式下的高饲养密度和常规抗生素使用也对ARGs的传播起到了显著的促进作用。

为了进一步揭示ARGs的传播机制，研究团队通过细菌分离、抗生素敏感性测试、ARGs的PCR检测、生物膜形成实验以及质粒介导的基因水平转移实验，系统性地验证了ARGs的传播路径。结果显示，*K. pneumoniae*是耐药传播的重要载体，其对β-内酰胺类抗生素的耐药率高达96.43%，并且有25%的菌株表现为多重耐药。更值得注意的是，通过共轭实验，研究确认了*bla*_SHV基因可以通过质粒在*E. coli*中发生水平转移，从而实现跨物种传播。此外，生物膜的形成能力与β-内酰胺类抗生素耐药性之间存在显著的正相关关系，表明生物膜在耐药基因的维持和传播中起着关键作用。

在研究方法部分，样本采集覆盖了山东五个城市的42个大型奶牛场，共收集了539个样本，包括141个生乳样本和398个环境样本（水源、牧草和乳房拭子）。样本在采集后立即置于4℃冷链运输箱中，并在6小时内送达实验室，随后在-80℃超低温冰箱中保存直至后续分析。DNA提取和宏基因组测序采用了标准的细菌基因组提取方法，确保了数据的准确性和完整性。研究还通过生物信息学分析对数据进行了深入处理，包括基因预测、功能注释和分类学分析，所有分析均基于高质量的DNA序列（平均Phred≥30，读长≥50 bp）。

实验验证部分采用了多种技术手段，以确保研究结果的可靠性。首先，通过选择性培养基分离了生乳中的潜在病原体，包括大肠杆菌（*E. coli*）、肺炎克雷伯菌（*K. pneumoniae*）、沙门氏菌（*Salmonella*）、志贺菌（*Shigella*）和乳房炎病原体*Streptococcus uberis*。进一步的抗生素敏感性测试（AST）显示，*K. pneumoniae*对β-内酰胺类抗生素的耐药率显著高于*E. coli*，其中对氨苄西林的耐药率达到了96.43%。同时，研究发现*K. pneumoniae*的生物膜形成能力与其对氨苄西林和青霉素的耐药性之间存在显著的正相关，这为理解耐药性在环境中的维持机制提供了重要线索。

在水平基因转移实验中，研究团队使用滤膜共轭法，确认了*bla*_SHV基因在*E. coli*中的转移能力。结果显示，当供体和受体均为*K. pneumoniae*时，基因转移频率最高（3.3×10^?5），而当受体为*Staphylococcus aureus*时，转移效率显著降低（6.1×10^?6）。这一发现表明，不同物种之间的基因转移效率存在显著差异，这可能与基因转移机制和宿主适应性有关。此外，研究还发现，大多数共轭菌株中检测到了*bla*_SHV基因，但部分菌株中该基因的缺失提示了基因转移的成功率可能存在个体差异。

研究进一步探讨了ARGs的生态和人为驱动因素。通过比较不同区域的ARGs分布，发现某些环境因素如重金属污染和抗生素残留可能在ARGs的传播中起到关键作用。例如，黄河三角洲地区的土壤中某些重金属的积累，可能通过激活微生物的应激反应通路，间接促进ARGs的富集。此外，集约化养殖中抗生素的频繁使用，可能对耐药菌株产生选择压力，从而推动其在环境中的传播。研究还指出，生物膜在ARGs的传播中具有重要作用，它不仅提供了物理屏障，还可能通过胞外DNA的交换促进耐药基因的转移。

在讨论部分，研究团队深入分析了ARGs在奶业全产业链中的传播路径和机制。他们指出，生物膜的存在可能为多重耐药质粒提供庇护所，从而促进其在环境中的水平转移。此外，肠道作为微生物聚集和基因交换的重要场所，可能成为ARGs传播的关键节点。一些研究已经表明，肠道中的菌群与质粒之间存在复杂的相互作用，质粒可以通过水平基因转移将耐药基因传播至不同的细菌克隆。因此，即使只有极少量的* K. pneumoniae*能够通过巴氏杀菌存活，它们也可能利用肠道微生态系统的条件，将耐药基因传播至其他微生物中。

研究还强调了环境因素对ARGs传播的影响。例如，农药残留和生长促进剂的积累可能加速微生物耐药性的传播。此外，生物膜的存在可能为耐药质粒提供庇护所，使其在环境中有更高的存活率和传播能力。结合本研究中分离菌株的质粒特征，研究团队推测，在奶业生产链中，*K. pneumoniae*及其携带的IncFIB型质粒可能成为ARGs传播的重要载体。

在防控策略方面，研究提出了多项建议，以减少ARGs在奶业中的传播。首先，建议在高风险区域推广宏基因组测序技术，作为监测ARGs传播的核心工具。这种技术不仅能够同时检测547种ARGs亚型和16,347种微生物，而且其灵敏度比传统培养方法提高了37%。此外，研究团队还开发了两种检测技术，包括基于荔枝状Ag@ZIF-8@Au等离子体纳米复合材料的SERS平台，能够实现对痕量污染物的高灵敏度检测；以及基于MXene/Au-apt-Au@Ag纳米探针的SERS生物传感器，可用于快速、特异性地检测牛奶中的耐药病原菌。这些技术为奶业中ARGs的防控提供了实际应用的支持。

为了进一步验证这些防控策略的可行性，研究建议在ARGs富集的区域（如DY）开展试点试验，以评估其在实际应用中的成本效益。同时，应严格限制预防性抗生素的使用，这已经在欧盟等地区被证明是有效的措施。此外，研究团队还提出，基于CRISPR的质粒消除技术可能成为未来防控ARGs传播的有力手段。尽管该技术在实验室中已显示出高达93%的清除率，但其大规模应用仍面临成本高、微生物群落干扰以及CRISPR抗性质粒快速演化的挑战。相比之下，乳铁蛋白（lactoferrin）作为一种天然的生物膜抑制剂，已被实验验证可减少生物膜强度高达52%，这为实际应用中的生物膜控制提供了更直接的解决方案。

本研究的结论指出，集约化养殖模式通过高密度动物饲养、频繁的抗生素使用以及大量废弃物排放，显著加速了ARGs的传播。在病原体中，*K. pneumoniae*被认为是最具传播风险的载体之一，其对β-内酰胺类抗生素的耐药率高达96.43%，且有25%的菌株表现为多重耐药。此外，*K. pneumoniae*的生物膜形成能力与其耐药性之间存在显著的正相关关系，表明生物膜在耐药基因的维持和传播中起着关键作用。跨物种传播的基因水平转移机制也表明，*bla*_SHV基因可以通过质粒在*E. coli*中传播，从而形成“细菌-基因共迁移”的传播模式。研究还发现，环境来源（如水源和牧草）占这些病原体的57.7%，进一步加剧了工业链中耐药性的传播。

综上所述，本研究不仅揭示了ARGs在奶业中的传播路径和机制，还为制定精准的防控策略提供了科学依据。通过整合宏基因组测序、实验验证和多学科分析，研究团队构建了一个全面的耐药基因传播模型，为全球奶业的抗生素耐药性管理提供了新的视角和方法。未来，研究建议在奶业中推广宏基因组监测、乳铁蛋白抑制生物膜形成以及基于CRISPR的质粒消除技术，以实现对ARGs传播的有效控制。同时，应结合地理信息系统（GIS）动态追踪高风险区域中的ARGs热点，以提高监测的精准度和效率。此外，研究还呼吁加强对抗生素使用的监管，优化抗生素管理策略，并探索新的技术手段，以减少耐药基因在奶业中的传播风险。