结直肠癌肿瘤细胞固有PD-1通过激活MAPK信号通路调控化疗耐药性的机制与临床意义研究

《BJC Reports》：Tumor cell-intrinsic PD-1 regulates chemotherapy resistance in colorectal cancer cells by activating downstream MAPK signaling

本研究针对结直肠癌(CRC)患者对PD-1免疫疗法反应有限的问题，深入探讨了肿瘤细胞固有PD-1(ciPD-1)在化疗耐药中的作用。研究人员通过临床队列分析和体外实验发现，高表达ciPD-1的CRC肿瘤更具侵袭性且预后较差，化疗应激可上调ciPD-1表达并通过激活MAPK/AKT信号通路促进细胞存活。抑制ciPD-1能显著增强5-FU和CPT-11的杀伤效果，为PD-1抑制剂与一线化疗联合应用提供了理论依据。

　　

在全球范围内，结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。尽管早期诊断和手术切除结合以5-氟尿嘧啶(5-FU)为基础的辅助化疗是目前最佳的治疗方案，但许多肿瘤会发展出耐药性，导致17-21%的患者在原发性肿瘤切除后出现复发。晚期结直肠癌通常采用以5-FU为基础的化疗方案，如FOLFIRI（联合伊立替康）或FOLFOX（联合奥沙利铂）。虽然针对表皮生长因子受体(EGFR)的西妥昔单抗或帕尼单抗可用于野生型KRAS肿瘤患者，而贝伐珠单抗可与化疗联合靶向血管内皮生长因子(VEGF)，但疗效均有限。过去二十年间，尽管结直肠癌治疗取得了进展，但晚期或复发性结直肠癌因其侵袭性强、对治疗不敏感且常发生转移，仍然是公共卫生领域面临的严峻挑战。

免疫治疗为结直肠癌患者提供了新的选择，特别是在调节抗肿瘤T细胞活性方面。然而，这类治疗通常仅在一线和二线治疗方案失败后才会考虑。不幸的是，多数结直肠癌患者对免疫治疗反应不佳，其原因可能包括肿瘤内T细胞浸润水平低以及肿瘤突变负荷低导致抗原呈递不足，从而难以激活有效的免疫应答。结直肠癌免疫治疗中最著名的例子是靶向PD-1/PD-L1轴，但仅有少数（3%至15%）具有高度微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)的患者能够从中获益。

近年来，研究发现在多种肿瘤类型中，包括黑色素瘤、肝细胞癌(HCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、甲状腺癌、食管腺癌和默克尔细胞癌等，肿瘤细胞本身也能表达PD-1，即细胞固有PD-1(cell-intrinsic PD-1, ciPD-1)。在黑色素瘤、肝细胞癌和甲状腺癌中，ciPD-1通过激活mTOR/S6/eIF4E或SHP2/RAS/MAPK通路促进肿瘤生长。表达ciPD-1的肿瘤细胞群体还表现出肿瘤起始细胞或癌症干细胞的特征。然而，在非小细胞肺癌中，ciPD-1的表达却通过抑制AKT和ERK1/2通路来抑制肿瘤生长，尽管这仅基于个别病例报告。与之相反，对化疗耐药的NSCLC细胞进行PD-1阻断却能增强化疗效果并延迟耐药性的出现。这些发现表明，ciPD-1在肿瘤中可能发挥着超越其免疫抑制功能的、具有环境特异性的调控作用。

基于此，本研究旨在探讨ciPD-1与结直肠癌患者生存结局的关系，并进一步研究其在结直肠癌细胞对5-FU和伊立替康(CPT-11)反应中的作用。研究结果揭示，ciPD-1高表达的结直肠癌患者生存结局显著较差。应激条件，包括化疗暴露，会提高结直肠癌细胞系中ciPD-1的基础水平。耐药细胞系中的ciPD-1水平高于其敏感对照，而抑制ciPD-1能使细胞对药物处理重新敏感。体外实验数据还表明，ciPD-1通过激活KRAS下游的MAPK和AKT信号通路来增强细胞在应激条件下的存活能力。综合患者和细胞系数据，本研究强有力地表明ciPD-1信号通路在结直肠癌中具有促肿瘤作用。数据进一步指出，抑制ciPD-1及其下游效应分子与一线或二线化疗联合使用，是一种值得在结直肠癌临床管理中考虑的新颖治疗策略。

研究人员综合利用了多个临床队列的基因表达数据和体外细胞模型来开展本研究。关键技术方法包括：1) 生物信息学分析：从TCGA、POG项目和GEO数据库（包括GSE50760数据集）获取685例结直肠癌样本的转录组数据和临床信息，进行生存分析、基因集富集分析(GSEA)和通路分析；2) 细胞模型：使用包括RKO、MIP-101等人在内的结直肠癌细胞系 panel，并利用实验室前期建立的5-FU和CPT-11耐药细胞系；3) 功能实验：通过siRNA干扰和PD-1抑制剂纳武利尤单抗(Nivolumab, Nivo)调控ciPD-1的表达或活性，采用MTS法检测细胞活力、克隆形成实验评估增殖、Western blot和免疫荧光分析蛋白表达及信号通路激活状态。

ciPD-1表达随肿瘤分期增加且与不良预后显著相关

对TCGA癌症图谱的分析显示，结直肠癌(COAD/READ)中PDCD1（编码PD-1的基因）mRNA表达水平处于中等水平，但相较于正常组织显著上调。对GSE50760队列（包含18例患者的匹配正常组织、原发灶和肝转移灶）的分析发现，同一患者体内，从正常组织、原发灶到转移灶，PDCD1 mRNA水平呈现递增趋势。超过60%的结直肠癌肿瘤PDCD1表达高于其匹配的正常组织，56%的肝转移灶PDCD1表达高于对应的原发灶。

生存分析显示，TCGA数据集中，PDCD1高表达与较差的疾病特异性生存率和总生存率显著相关。此外，PD-1高表达的肿瘤与更高的突变计数、肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性MANTIS评分相关。

ciPD-1表达与患者肿瘤中KRAS/MAPK通路激活密切相关

基因集富集分析(GSEA)表明，在TCGA数据库中PD-1高表达的患者组，以及GSE50760队列中转移灶相较于原发灶，多个关键的肿瘤生存相关标志通路被高度富集，包括KRAS信号网络、缺氧信号、P53和ROS通路。TCGA数据显示，PD-1高表达患者KRAS信号通路活性上调。GEPIA2分析进一步显示，PDCD1表达与MAPK1、MAPK2、MAP2K1、AKT1、AKT2等基因表达呈正相关。KEGG通路富集分析也支持MAPK信号通路在PD-1高表达患者和转移灶中上调。

应激条件下结直肠癌细胞系上调ciPD-1表达水平

研究人员在体外检测了一系列结直肠癌细胞系中ciPD-1的表达。qRT-PCR和Western blot结果证实，不同细胞系中ciPD-1的mRNA和蛋白表达水平存在差异，其中RKO和SW480细胞表达较高。值得注意的是，在实验室前期诱导的5-FU和CPT-11耐药的RKO和MIP-101细胞系中，ciPD-1的表达水平均高于其亲本敏感细胞。当用放射线、5-FU、CPT-11处理化疗敏感的RKO和MIP-101细胞，或进行血清剥夺（模拟营养匮乏）时，ciPD-1的表达水平在短时间内即出现上调。免疫荧光染色进一步证实了化疗应激后ciPD-1蛋白沉积的增加。

通过siRNA或纳武利尤单抗调控ciPD-1表达使结直肠癌细胞对5-FU和CPT-11敏感，产生协同细胞死亡效应

为了评估ciPD-1对细胞活力和化疗疗效的影响，研究人员使用siRNA干扰或纳武利尤单抗(Nivo)来抑制RKO和MIP-101细胞中ciPD-1的表达或活性。结果显示，Nivo单药对细胞活力或克隆形成能力无显著影响，但当Nivo与5-FU或CPT-11联合使用时，能显著降低克隆形成和细胞增殖，尤其以Nivo联合CPT-11的效果最为明显。联合治疗的效应被证明是协同的。通过siRNA成功敲低ciPD-1后，细胞对5-FU和CPT-11的敏感性显著增加，细胞活力明显降低。在5-FU和CPT-11耐药的RKO细胞系中，加入Nivo能够降低其对5-FU和CPT-11的半数抑制浓度(IC₅₀)，使其重新变得敏感。

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ciPD-1在耐药细胞中调控KRAS下游MAPK和AKT信号通路

根据临床队列的GSEA结果提示ciPD-1与MAPK和AKT通路相关，研究人员在细胞模型中进行了验证。在ciPD-1被siRNA敲低的RKO和MIP-101细胞中，磷酸化MAPK(pMAPK)/总MAPK、磷酸化MEK(pMEK)/总MEK以及磷酸化AKT(pAKT)/总AKT的比率均显著降低，表明这些关键信号通路的活性受到抑制。同样，用Nivo处理细胞后，随着ciPD-1水平的下降，pMAPK/MAPK、pMEK/MEK和pAKT/AKT的比率也呈现剂量依赖性的下降。在5-FU和CPT-11耐药的RKO和MIP-101细胞中，ciPD-1水平升高的同时，MAPK和AKT通路的磷酸化水平也相应增强。而当用Nivo处理这些耐药细胞时，ciPD-1被抑制，相应的蛋白磷酸化水平也随之下降。

研究结论与讨论

本研究通过整合临床队列数据和体外实验，揭示了结直肠癌中肿瘤细胞固有PD-1(ciPD-1)的重要功能。研究发现，ciPD-1的高表达与结直肠癌患者的不良预后密切相关，且其表达水平随着肿瘤进展（从原发灶到转移灶）而增加。在细胞层面，化疗应激可诱导ciPD-1表达上调，而ciPD-1则通过激活MAPK和AKT信号通路来促进癌细胞在应激条件下的存活，从而介导了对5-FU和CPT-11的化疗耐药。抑制ciPD-1（通过siRNA或纳武利尤单抗）能够逆转这种耐药性，增强化疗药物的杀伤效果，并产生协同作用。

这些发现具有重要的临床意义。首先，ciPD-1可能作为结直肠癌预后的生物标志物以及潜在的原发性或获得性化疗耐药的预测指标。更重要的是，本研究为将PD-1抑制剂（如纳武利尤单抗）与一线化疗方案联合使用提供了强有力的理论依据。目前，纳武利尤单抗等多用于化疗难治性结直肠癌的三线免疫治疗。本研究结果提示，在初始化疗时即联合靶向ciPD-1，可能通过增强化疗疗效、延缓或防止高表达ciPD-1的克隆被选择性富集，从而阻碍化疗耐药的发展。一些正在进行的临床试验（如CheckMate 649、CheckMate 9X8等）已在其他癌种或结直肠癌中探索一线化疗联合PD-1抑制剂的方案，并显示出前景，这进一步支持了本研究结论的潜在转化价值。

总之，本研究首次系统地阐述了ciPD-1在结直肠癌化疗耐药中的关键作用及其通过MAPK信号通路的分子机制，深化了对PD-1在肿瘤细胞自身生物学中功能的理解，并为改善结直肠癌治疗策略提供了新的思路。然而，ciPD-1在肿瘤微环境中与PD-L1等其他因素的相互作用，以及其在不同遗传背景结直肠癌中的确切角色，仍有待未来更深入的研究。