厌氧条件下芘的生物降解与Paracoccus versutus菌株PYRN-PV介导的硝酸盐还原过程耦合

《Journal of Environmental Management》：Anaerobic pyrene biodegradation coupled to nitrate reduction by a Paracoccus versutus strain PYRN-PV

硝酸盐还原微生物PYRN-PV通过羧化、甲基化及氧化等步骤实现高效厌氧吡噁啉降解，并揭示其代谢通路及扩展至其他多环芳烃的降解能力。

　　本研究聚焦于一种新的硝酸盐还原微生物，该微生物能够在厌氧条件下有效降解芘。芘作为一种高分子量多环芳烃（HMW-PAH），由四个苯环组成，具有高度的毒性和致癌性，广泛存在于自然环境中。由于其疏水性和持久性，芘容易在土壤和沉积物中积累，对生态系统和人类健康构成潜在威胁。因此，如何有效去除或减少环境中的芘污染成为环境科学研究的重要议题。

与传统的物理和化学修复方法相比，生物修复因其经济性和环境友好性而受到越来越多的关注。在好氧条件下，芘的生物降解已被广泛研究，相关微生物及其代谢途径也较为明确。然而，在许多受污染的环境中，氧气含量有限，使得好氧降解难以实施。因此，厌氧降解成为一种重要的替代手段，尤其是在缺氧的环境如地下水层、深层土壤和水底沉积物中。这些环境由于有机质含量高或扩散受限，常出现氧气耗尽的情况。尽管如此，目前对于厌氧条件下芘的生物降解潜力仍缺乏系统研究。

微生物的硝酸盐还原作用是氮循环中的关键过程。在这一过程中，硝酸盐被逐步还原为亚硝酸盐、一氧化氮、氧化亚氮，最终转化为氮气，或者通过其他途径转化为亚硝酸盐和铵。这一过程使微生物能够在缺氧条件下利用硝酸盐作为替代的电子受体，从而实现有机污染物的降解。相较于其他电子受体（如硫酸盐和铁离子），硝酸盐具有更高的氧化还原电位，能够为微生物提供更多的能量，因此更有利于高效的降解过程。目前已知能够利用硝酸盐作为电子受体进行芘降解的微生物主要包括*Paracoccus denitrificans*和*Castellaniella*属的某些菌株。

然而，关于能够进行厌氧芘降解的微生物种类仍存在较大空白。此前的研究主要集中在硫酸盐还原条件下芘的降解机制，例如*Desulforamulus aquifer*菌株。研究表明，芘首先通过羧化反应转化为芘-2-羧酸，随后经历环还原和环裂解步骤，最终生成苯衍生物、短链脂肪酸和二氧化碳等产物。此外，某些研究还发现，芘可能是苯并[a]芘厌氧降解过程中的中间产物，其降解产物包括4,5-二氢芘、菲、菲衍生物、萘、萘衍生物和苯衍生物等。然而，这些研究中的一些中间代谢产物被认为缺乏关键的初始活化产物，或者在理论上存在不合理之处，这表明对厌氧条件下芘降解机制的理解仍需进一步深入。

基于上述研究背景，本研究旨在：1）鉴定能够利用硝酸盐作为电子受体进行芘降解的新类型微生物；2）探索其对应的代谢特征，包括芘降解速率、离子转化率和微生物生长情况；3）揭示在硝酸盐还原条件下厌氧芘降解的机制，涵盖初始活化步骤、关键中间步骤以及调控基因。为了实现这些目标，研究首先通过富集培养的方法分离出能够同时降解芘和还原硝酸盐的纯菌株，并进一步对其生理和代谢特性进行系统分析。

研究中分离出的菌株命名为PYRN-PV，其16S rRNA基因序列（1350 bp）在系统发育分析中显示出与*Paracoccus versutus*的最高相似性，该菌属于变形菌门（Pseudomonadota）的α-变形菌纲（α-Proteobacteria）、红杆菌目（Rhodobacterales）、拟杆菌科（Paracoccaceae）和拟杆菌属（Paracoccus）。此外，PYRN-PV的基因组与*Paracoccus versutus*的平均核酸相似性指数（ANI）达到98.22%，表明该菌株与已知的*Paracoccus versutus*具有高度的遗传相似性。

在代谢特性方面，PYRN-PV能够在20天内将99.6%的芘降解为无害产物，同时将硝酸盐还原为氮气。这一结果表明，该菌株在厌氧条件下具有极强的芘降解能力。为了进一步解析其代谢途径，研究团队结合了代谢物分析、同位素代谢分析、基因组学和实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）等多学科方法，系统地揭示了PYRN-PV在硝酸盐还原条件下进行芘降解的完整代谢路径。

研究发现，芘的初始活化过程主要通过羧化和甲基化两种方式进行。首先，芘被羧化为芘-2-羧酸，这一过程由特定的基因调控。随后，芘经历甲基化反应，生成2-甲基芘。值得注意的是，甲基化步骤被认为是厌氧芘降解中的一个新机制，这为理解芘的生物降解提供了新的视角。在后续的代谢过程中，2-甲基芘被直接氧化为芘-2-羧酸，这表明在该菌株的代谢体系中，氧化和还原反应可以相互配合，以实现更高效的降解。

在中间代谢阶段，研究团队观察到两个关键步骤：辅酶A（CoA）连接和氢化环还原。辅酶A连接是将芘-2-羧酸转化为相应的CoA衍生物，这一过程有助于后续的代谢反应。氢化环还原则进一步减少芘分子的环结构，使其更易被裂解。这些中间步骤的发现，不仅揭示了PYRN-PV的代谢路径，也为其他类似微生物的代谢研究提供了参考。

在下游代谢阶段，研究团队识别了多个关键反应。首先，芘分子发生环裂解，生成苯衍生物。随后，环结构被进一步还原，生成环己酮衍生物。最后，通过环裂解和矿化作用，芘被完全分解为短链脂肪酸和二氧化碳。这些代谢产物的生成过程表明，PYRN-PV在降解芘的过程中能够实现其完全矿化，而不是仅仅将其转化为其他芳香烃类化合物。这一发现对于理解芘在自然环境中的最终去向具有重要意义。

除了芘，PYRN-PV还能够利用其他芳香烃类化合物作为碳源，包括苯、萘、蒽、菲和苯并[a]芘。这些化合物的降解效率均超过99%，说明该菌株具有广泛的底物适应性。这一特性使其在实际应用中具有更大的潜力，特别是在处理多种多环芳烃污染的环境中。此外，PYRN-PV在降解过程中表现出良好的生长特性，这有助于其在实际环境中的应用和推广。

在基因调控方面，研究团队通过基因组分析和RT-qPCR技术，鉴定了PYRN-PV中与芘降解相关的关键基因。这些基因不仅参与了芘的初始活化和中间代谢，还调控了最终的环裂解和矿化过程。通过对这些基因的深入研究，可以更好地理解微生物在厌氧条件下的代谢调控机制，并为未来的基因工程改造提供理论依据。

本研究的成果不仅丰富了对厌氧条件下芘降解机制的认识，还为实际环境中的生物修复提供了重要的理论支持和实践指导。在缺氧的环境中，如地下水层、深层土壤和水底沉积物，PYRN-PV的出现表明硝酸盐还原微生物可以作为有效的生物修复工具。此外，该菌株对多种芳香烃类化合物的降解能力，使其在处理复杂污染环境时具有更高的适应性和效率。

综上所述，本研究通过系统的实验和分析，揭示了PYRN-PV在硝酸盐还原条件下进行芘降解的完整代谢路径，并确认了其在环境修复中的潜在应用价值。未来的研究可以进一步探索该菌株的生态分布、环境适应性以及与其他微生物的协同作用，以期在实际应用中实现更高效的生物修复效果。