健康因素和铁载体影响大肠杆菌在重复使用的肉鸡垫料中的存活率

《Journal of Food Protection》：Fitness factors and siderophores influence the survival of E. coli in reused broiler litter

Escherichia coli在重复使用的鸡舍垫料中携带抗生素耐药性（AMR）和毒力因子（VF）基因，其分布与管理因素（如鸡群、鸡舍、生长阶段）和环境因素（如垫料pH、湿度、温度）显著相关。研究发现第一鸡群AMR/VF基因携带率最高，可能与适应新环境有关。通过生长实验和转录组/蛋白质组分析，揭示了ST117菌株在铜和铁胁迫下的生长差异及蛋白质表达变化，表明垫料管理对病原体控制至关重要。

　　E. coli（大肠杆菌）是一种在许多动物体内，包括人类和鸡中常见的细菌。它在维持宿主健康方面发挥积极作用，例如促进微量元素的生成和增强免疫系统功能。然而，某些E. coli菌株可以引起人类和家禽的疾病，从而带来严重的公共卫生和经济问题。例如，在人类中，致病性E. coli菌株如肠出血性大肠杆菌（EHEC）可导致溶血性尿毒综合征（HUS）和腹部及盆腔感染。在美国，据估计每年有超过265,000例E. coli感染病例，最常见的传播途径是食用受污染的食物，尤其是生食或未充分烹饪的肉类。在禽类中，禽源性致病性大肠杆菌（APEC）是引起禽类大肠杆菌病的主要原因，这种疾病在禽类产业中造成显著的经济损失。APEC与外源性致病性大肠杆菌（ExPEC）共享许多毒力因子，后者能够引起人类的尿路感染、败血症和脑膜炎。值得注意的是，序列类型117（ST117）是一种在APEC和ExPEC中都发现的重要谱系，携带一系列毒力基因，如iss、iroN、iucD和hlyF，并因其在禽类中的高发性和与人类致病性菌株的基因重叠，被认为是一种潜在的跨物种传播威胁。

除了直接致病性，E. coli还因其作为某些抗菌素耐药性（AMR）和毒力因子（VF）基因的载体和储存库而备受关注。这些基因可以通过水平基因转移传递给其他病原体，如沙门氏菌，从而导致耐药性的传播。这在治疗细菌感染时构成了重大挑战，因为这限制了抗生素的有效性并增加了治疗失败的风险。

移动遗传元件如ColV质粒或I类整合子在E. coli中促进AMR和VF基因的传播。ColV质粒是大型的共轭质粒，常与APEC相关，并被认为是外源性致病性的关键贡献者。I类整合子是能够捕获和表达基因盒的遗传元件，通常编码抗生素耐药性。它们被广泛认为是AMR的标志，并在抗生素耐药基因的水平基因转移中发挥重要作用。因此，E. coli中这些遗传元件的出现可能是多药耐药性和毒力的指标。

鸡肉是全球消费量最大的肉类之一，美国在生产和消费方面均处于领先地位。根据美国农业部经济研究服务局的报告，美国的平均每人每年消耗超过60磅的鸡肉。肉鸡通常在垫料上饲养，从孵化到收获的时间约为56天。在美国，由于经济和环境效益，垫料通常在多个鸡群之间重复使用。然而，垫料可以携带病原体，如沙门氏菌、E. coli和弯曲杆菌，这些病原体可能在时间推移中持续存在并传播给新的鸡群。鉴于肉鸡具有摄食粪便的特性，以及潜在的气溶胶传播途径，重复使用的垫料可能是获取病原菌的主要途径。此外，预收获阶段的微生物污染可能会延续到加工阶段，导致禽类生产中的后处理污染。

尽管许多研究已经报告了禽类垫料中食源性病原体的存在，但很少有研究探讨这些病原体在预收获禽类生产中持久的遗传因素。鉴于它们作为AMR和VF基因的载体和储存库的重要性，研究不同鸡群重复使用垫料中E. coli的基因组差异对于控制禽类生产中的病原体至关重要。此外，研究管理因素（如鸡群编号、鸡舍、鸡舍内的位置、区域和生长阶段）与环境因素（如垫料湿度、pH值和鸡舍温度）与AMR和VF基因出现之间的关系，可以提供关于选择压力如何允许某些病原体在重复垫料中存活的见解。

全基因组测序（WGS）能够全面了解细菌菌株的基因组特征，以及特定的遗传背景，如适应性因子。在本研究中，我们使用了从四个肉鸡鸡舍中重复使用的垫料中获得的217个E. coli菌株的WGS数据，基于之前的研究报告指出在肉鸡垫料中E. coli的高流行率。我们的目标包括：i）比较不同管理因素下的E. coli菌株的基因组差异；ii）表征E. coli的适应性因子基因，并调查它们与环境和管理因素之间的关联；iii）研究E. coli在相关应激条件下的生长动态，以及其转录和蛋白质组的响应。

研究设计和垫料采样：在2018年2月至8月期间，从位于美国佐治亚州的四个共存的集成肉鸡鸡舍中收集了288个垫料样本，这些样本来自三个连续的鸡群。在引入第一个肉鸡鸡群之前，进行了彻底的清洁工作。随后的鸡群则在不进行清洁的情况下饲养，通过机械方式清除结块垫料，并应用商业垫料酸化剂以控制氨气。前14天采用半鸡舍育雏方式，以维持小鸡早期生长阶段的均匀环境条件。饮用水中补充了硫酸铜。这些程序属于美国肉鸡产业的常规管理实践。

垫料采样发生在每个鸡群的两个时间点：早期生长阶段（小鸡年龄4-14天）和晚期生长阶段（32-38天），共计六个采样时间点。每个鸡舍被分为三个区域和四个部分（前、中前、中后、后），形成了12个子区域。每个子区域收集三个垫料样本并进行混合。样本被冰上运输至美国国家禽类研究实验室进行处理，处理时间不超过24小时。

垫料湿度含量通过比较干燥前后的重量变化来确定，将大约1克的垫料在107°C下干燥24小时。湿度含量通过计算干燥前后垫料的重量差异得出。pH值通过测量垫料浆液（10克垫料在20毫升超纯水中）来确定，使用Thermo-Scientific Orion探针进行测量。鸡舍温度则从每个鸡舍控制室的恒温器在采样时记录。

E. coli的分离和鉴定：根据Oladeinde等人的描述，30克混合的垫料样本与120毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）混合，并使用手动腕部摇摆机（Boekel Scientific, 401000, Feasterville-Trevose, PA, USA）摇摆10分钟。随后，将混合物离心处理4,800 × g 30分钟，收集上清液。垫料提取物通过0.45微米的Steriflip?真空过滤单元（Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA）进行过滤。对于每个鸡群，将四个垫料提取物进行合并，并用于后续的细菌生长实验。在生长实验中，使用含有调整为10^3 CFU/mL的细菌悬液（ST117菌株TE207）接种于96孔板中，每个处理包含十个生物学重复。孔板在37°C下培养24小时，并在Agilent Technologies的EPOCH2微板读数仪中进行连续摇摆。每30分钟记录600纳米波长（OD600）的光密度值。每个处理中包含十个空白孔以进行背景校正。

为了确定E. coli的AMR表型，我们对所有菌株进行了抗菌素敏感性测试（AST），使用NARMS的革兰氏阴性菌微量稀释板。超过一半的菌株（127/217）至少对一种抗菌素具有耐药性。其中，80株对单一抗菌素耐药，8株对两种抗菌素耐药，38株对三种或更多抗菌素耐药。第一鸡群中，完全敏感菌株的比例显著低于第二鸡群（46.8%）和第三鸡群（47.4%）。此外，第一鸡群中对单一抗菌素耐药的菌株比例显著高于第二鸡群（34.0%）和第三鸡群（35.6%），尽管这一差异在统计学上不显著。然而，第一鸡群中对三种或更多抗菌素耐药的菌株比例显著高于第二鸡群（14.9%）和第三鸡群（11.9%）。

在检查AMR与遗传元件（如ColV质粒或intI1基因）之间的关系时，发现多药耐药（MDR）E. coli菌株更常与这些元件相关。具体来说，44%的ColV阳性菌株表现出MDR表型，而46%的ColV阴性菌株不表现出MDR表型。此外，70%的intI1阳性菌株表现出MDR表型，而超过80%的intI1阴性菌株要么对所有抗菌素敏感，要么仅对一种抗菌素耐药。这些发现表明，AMR特征的分布与毒力和MDR相关遗传元件的存在有关，并可能随连续的肉鸡鸡群而变化。

管理因素和环境变化与E. coli适应性因子的携带有关。88个适应性因子基因在不同鸡群和小鸡年龄之间显示出显著差异。其中，59个基因在第一鸡群中更为常见，24个基因在第二鸡群中更为常见，5个基因在第三鸡群中更为常见。值得注意的是，金属耐药基因（n=18）和生物杀灭剂耐药基因（n=8）在第一鸡群中比第二鸡群和第三鸡群更为常见。这包括对15种金属化合物的耐药基因，如砷（As）、铬（Cr）、镍（Ni）、铁（Fe）、钴（Co）、镓（Ga）、锰（Mn）、锌（Zn）、铜（Cu）、镉（Cd）、碲（Te）、银（Ag）、钒（V）、钼（Mo）和铅（Pb）的耐药基因。这些结果表明，适应性因子的分布与管理因素有关，并可能在连续的肉鸡鸡群中发生改变。

E. coli菌株在不同生长阶段、鸡群和鸡舍中的异质性：在第一鸡群中发现的E. coli菌株携带了更多的适应性因子，包括铁获取相关的铁载体合成基因，如yersiniabactin（ybt）、aerobactin（iuc）和salmochelin（iro）基因，以及ColV质粒、I类整合酶基因（intI1）和金属耐药基因。这些适应性因子可能在适应新环境时发挥关键作用。转录和蛋白质组分析显示，大多数ST117菌株在酸化硫酸铜暴露下抑制了铁载体基因的表达和生长所需的蛋白质，但有一个菌株（TE207）表现出显著的适应性提升。这些发现强调了适应性因子的异质性，以及垫料管理实践在控制禽类生产中病原体的重要性。

本研究揭示了E. coli在重复使用的垫料中表现出的适应性特征的多样性。通过全基因组测序和生物信息学分析，我们发现不同鸡群中的E. coli菌株在基因组水平上存在显著差异，这些差异与管理因素和环境因素相关。此外，不同鸡群和生长阶段中的E. coli菌株在适应性因子的携带上也表现出差异，这可能与环境压力和选择压力有关。研究还发现，ST117菌株在酸化硫酸铜暴露下表现出不同的适应性特征，其中TE207菌株表现出显著的适应性优势。这些发现有助于理解E. coli在禽类生产中的适应性特征及其与管理实践的关系。