核糖体蛋白bL31c与翻译延伸因子RAB8D相互作用，从而调控拟南芥叶绿体的翻译延伸过程以及PSI-LHCI-LHCII复合物的组装

《Journal of Genetics and Genomics》：Ribosomal protein bL31c interacts with translation elongation factor RAB8D to regulate chloroplast translation elongation and PSI-LHCI-LHCII assembly in Arabidopsis

bL31c-RAB8D相互作用调控叶绿体翻译延伸效率及光合系统组装平衡，发现bL31c是叶绿体70S核糖体大亚基蛋白，通过与RAB8D（EF-Tu）结合确保翻译延伸，其缺陷导致PSI亚基合成减少、LHCII磷酸化异常并积累PSI-LHCI-LHCII超复合体，同时进化分析揭示bL31c与蓝细菌bL31s功能保守但结构分化，为解析真核生物叶绿体翻译调控机制提供新视角。

　　植物在进化过程中，其叶绿体的翻译系统已经发展出与原核生物祖先不同的专门调控机制。然而，我们对这些系统如何协调翻译效率与光合装置组装的理解仍存在关键性空白。本研究中，我们识别出拟南芥中的一个关键叶绿体核糖蛋白——bL31c，它与翻译延伸因子RAB8D相互作用，确保叶绿体翻译的延伸效率。敲低bL31c会导致叶绿体翻译受阻，进而造成光系统I（PSI）亚基的优先消耗，引发PSI与PSII之间的功能失衡，并导致PSI-LHCI-LHCII超复合物的异常积累。通过比较分析，我们发现bL31c-EF-Tu功能模块在蓝藻中具有进化保守性，但在大肠杆菌中则没有，这表明翻译监视机制在不同谱系中发生了适应性变化。重要的是，对野生型植物的翻译延伸过程进行药理学抑制会重现bl31c突变体中观察到的光系统组成缺陷，这确立了缺陷的核糖体过程性是光系统失衡的主要驱动因素。我们的发现揭示了植物特有的核糖体检查点机制，该机制动态协调蛋白质合成与光合复合物的组装，为理解真核生物中细胞器基因表达系统的进化重排提供了重要见解。

光合作用是将太阳能转化为化学能的最关键生化反应，这一过程由四个光系统复合物依次介导：光系统II（PSII）、细胞色素b6/f复合物（Cyt b6/f）、光系统I（PSI）和ATP酶复合物。PSII催化水-质体醌的氧化还原反应，而PSI则通过光能驱动将质体醌氧化为铁氧还蛋白。在维管植物中，PSI和PSII均是由核心复合物和外围天线系统组成的多亚基色素-蛋白复合物。PSI的外围天线由四个LHCI亚基（Lhca1–Lhca4）组成，形成两个异二聚体并结合到PSI核心上，而PSII的天线系统则由三种不同的LHCII蛋白（Lhcb1–Lhcb3）组成，这些蛋白形成异三聚体并结合到PSII核心复合物上。LHCII三聚体根据其与PSII的结合强度被分为三类：S-LHCII三聚体通过CP43和CP26与PSII强结合，M-LHCII三聚体则通过CP29和CP24与PSII中度结合，L-LHCII三聚体在状态转换期间可逆地与PSI或PSII结合，从而适应自然环境中的光照波动。这种动态过程受到特定激酶和磷酸酶的调控，如状态转换7（STN7）激酶和类囊体相关磷酸酶38（TAP38），这些调控因子共同维持PSI和PSII之间的激发能量平衡。在状态II中，磷酸化的LHCII会结合到PSI上，形成PSI-LHCI-LHCII超复合物。光系统生物合成和对变化的光照环境的适应均依赖于相关基因的精确表达调控。

叶绿体是半自主的细胞器，其起源可以追溯到一个古老的蓝藻内共生体。在随后的内共生共进化过程中，叶绿体基因组经历了显著的缩减，仅保留了大约120个基因，这些基因参与转录、翻译和光合作用。而大部分祖先的叶绿体基因要么丢失，要么转移到了核基因组中。核编码的蛋白质在细胞质中合成后被导入叶绿体，同时叶绿体也会通过逆行信号传递至核，以调控基因表达，这表明叶绿体基因表达的调控相较于蓝藻或其他原核生物更为复杂。与大肠杆菌中的转录调控相比，叶绿体中的后转录和翻译事件在调控过程中扮演着更为重要的角色，而转录调控的影响则相对有限。此外，叶绿体中还出现了一种普遍的进化趋势，即通过核糖体蛋白（RPs）取代rRNA结构域和酶活性。为了适应这一趋势，叶绿体70S核糖体经历了一系列复杂的蛋白质变化。叶绿体中存在特有的核糖体蛋白（PSRPs），包括PSRP1–6，而RPL25和RPL30则已被丢失。在某些物种中，RPL23被其细胞质80S核糖体的同源蛋白取代，一些亚基变得不再必需。此外，一些其他核糖体蛋白表现出额外的延伸，这些延伸会重塑mRNA和多肽的进入或退出通道，表明核糖体蛋白可能参与翻译调控。然而，叶绿体翻译过程的变化及其众多翻译因子的分子功能仍有待阐明。

翻译延伸过程主要包括三个步骤：解码、肽键形成和移位，这些过程依赖于不同的因素，如延伸因子G、Tu和Ts（EF-G、EF-Tu和EF-Ts）。EF-Tu是一种普遍存在的鸟苷三磷酸酶（GTPase），最初在大肠杆菌中被鉴定。它负责将氨基酰基-tRNA（aa-tRNA）运输到核糖体的A位点，并触发鸟苷5′-三磷酸（GTP）的水解。在大肠杆菌中，70S核糖体通过EF-Tu与核糖体蛋白bL12之间的相互作用招募三元复合物（EF-Tu、GTP和aa-tRNA）。然而，叶绿体核糖体和蓝藻中EF-Tu的招募机制尚不清楚。在拟南芥中，核编码的RAB8D已被鉴定为叶绿体靶向的翻译延伸因子EF-Tu，使用源自大肠杆菌的翻译系统进行研究。RAB8D的敲除会导致致死，而其敲低则会导致植株呈现黄化表型，表现为叶绿素含量和光合能力的下降。理论上，RAB8D的主要功能是运输aa-tRNA到核糖体，但其与叶绿体核糖体的结合位点仍有待探索。

在本研究中，我们鉴定出一个同源致死基因bl31c（AT1G75350），该基因编码拟南芥中叶绿体靶向的核糖体蛋白bL31c。敲低bl31c的表达会导致幼苗黄化，并延迟突变体的生长。bL31c的缺乏会破坏光合活性的平衡，导致PSI-LHCI-LHCII超复合物的异常积累。值得注意的是，bL31c与RAB8D相互作用，并参与叶绿体翻译。同样，RAB8D的突变和野生型植物中化学诱导的翻译延伸缺陷均重现了bl31c突变体的表型。这些结果表明，叶绿体核糖体蛋白bL31c通过与翻译延伸因子RAB8D的相互作用参与叶绿体翻译。此外，受损的叶绿体翻译延伸会导致PSI和PSII的不均衡生物合成，进而导致PSI-LHCI-LHCII超复合物的过度积累。

为了进一步研究bl31c的生物学功能，我们获得了另一个等位基因bl31c-2（SALK_091486），该基因在bL31c的3′非翻译区（UTR）中存在T-DNA插入。定量PCR分析显示，bl31c-2突变体中的bL31c mRNA丰度仅为野生型（WT）的16%。bl31c-2突变体表现出幼苗黄化和生长迟滞的表型。电子显微镜下的叶绿体形态分析显示，bl31c-2突变体的叶绿体大小从约24 μm2减少到10 μm2，而淀粉颗粒的大小也减少到野生型的22%。此外，bl31c-2突变体的类囊体片层几乎无法检测到，这表明这些突变体在光合机器装配和淀粉生物合成方面受到了严重影响。

为了确认这些表型是由于bL31c的敲低引起的，我们生成了RNA干扰（RNAi）转基因植物。与bl31c-2类似，七条独立的RNAi线均表现出不同程度的黄化和生长迟滞，且bL31c的表达水平与表型严重程度呈反比。我们选择了其中一条RNAi线（bl31c-RNAi#2），其bL31c表达水平略低于bl31c-2，用于后续实验，命名为bl31c-i。bl31c-2和bl31c-i突变体的叶绿素含量和鲜重均显著降低，这证实了严重的表型缺陷是由bL31c的缺乏引起的。

为了进一步验证基因因果关系，我们通过将35S启动子驱动的bL31c-FLAG融合构建体转化bl31c-2突变体，获得了两条独立的互补线（bl31c com#1和bl31c com#2），其中bl31c com#2被用于后续实验，命名为Com。免疫印迹分析确认了互补线中bL31c-FLAG融合蛋白的表达。重要的是，bl31c突变体的黄化和生物量减少表型在这些互补线中得到了完全恢复。综上所述，bl31c突变体的严重表型缺陷，以及通过遗传互补得到的恢复，表明bL31c在拟南芥中发挥着特定且非冗余的生物学功能。

由于bl31c-2和bl31c-i突变体的光合活性缺陷，我们进一步研究了光系统复合物的丰度和组装情况。蓝原胶（BN-PAGE）分析显示，bl31c突变体中第四条带的丰度显著增加，而第五条带的丰度减少至野生型水平的约75%。其他分辨的带在突变体和野生型之间没有显著差异。为了表征这些差异带的蛋白质组成，我们进行了二维SDS-PAGE（2D-SDS-PAGE）与免疫印迹分析，针对四个主要类囊体膜复合物的核心亚基：PSI（PsaA、PsaF、PsaH）、PSII（D2、LHCII、PsbO）、细胞色素b6/f（PetA、PetB、PetC）和CF0-CF1（ATPA）。免疫检测显示，第四条带主要包含PSI亚基和LHCII，这与PSI-LHCI-LHCII超复合物的组成一致。

由于PSI-LHCI-LHCII超复合物的形成依赖于LHCII的磷酸化，我们进一步检测了类囊体膜蛋白的磷酸化水平。结果表明，bl31c突变体中的LHCII磷酸化水平显著高于野生型。因此，磷酸化的LHCII与PSI结合，形成PSI-LHCI-LHCII超复合物，这与观察到的第四条带的迁移变化一致。为了研究PSI组装异常是否源于光合蛋白的积累受损，我们以相等的叶绿素含量为基础，量化了四个类囊体膜复合物的代表性亚基。在所有光合复合物中，PSI亚基在bl31c突变体中表现出最严重的减少，影响了核编码和叶绿体编码的蛋白质。这些结果表明，bL31c的缺乏可能通过影响PSI亚基的积累而导致PSI组装异常。

为了探讨bL31c的分子功能及其在bl31c突变体中异常光系统组装的机制，我们研究了bL31c蛋白的亚细胞定位。我们使用拟南芥原生质体瞬时表达bL31c-YFP融合构建体，并通过共聚焦显微镜观察其荧光。结果表明，bL31c特异性定位于叶绿体。为了进一步表征其叶绿体定位，我们使用10%–50%蔗糖密度梯度对Com植物的叶绿体提取物进行分离，得到八个组分。通过使用抗-FLAG（用于检测bL31c）、RPL15（叶绿体核糖体大亚基）、抗-RbcL（基质标记）和抗-PC（类囊体标记）抗体的免疫印迹分析显示，bL31c与叶绿体核糖体大亚基共沉淀，表明其是叶绿体核糖体大亚基的组成部分，并参与翻译过程。

由于bL31c是叶绿体核糖体的组成部分，它可能影响叶绿体翻译。因此，我们进行了qPCR、RNA-seq、核糖体测序（ribo-seq）和蛋白质组分析，比较了野生型和bl31c突变体的这些数据，计算了每个数据集的bl31c/WT比值（qPCR、RNA-seq FPKM、ribo-seq RPKM和蛋白质丰度）。高通量分析的质量控制数据见图S3，核糖体测序的三核苷酸周期性见图S4。为了验证qPCR数据，我们使用ACTIN2和EIF4A1作为内参基因，以确保定量的准确性。对于核编码的光系统基因，其在转录组、翻译组和蛋白质组中的变化一致，验证了这些基因作为内参的可靠性。相比之下，叶绿体编码的亚基表现出从转录组到蛋白质组的折变化，表明bL31c对叶绿体翻译具有广泛的影响。叶绿体编码的光系统基因在突变体中表现出略微升高的RNA水平。虽然大多数叶绿体编码的光系统基因保持与野生型相似的核糖体占有率（RPKM变化≈1），但PsaA（0.65）、PsaB（0.64）和其他几个亚基的RPKM值降低。蛋白质组分析显示，光系统亚基的丰度普遍降低，其中PSI亚基的减少最为严重（平均变化≈0.4；例如，PsaA：0.43，PsaC：0.44，PsaE：0.42），与其他光系统亚基（≈0.6变化）相比。核糖体测序进一步分析了叶绿体转录物上的翻译核糖体位置，显示不同基因型之间没有全局的翻译模式变化。综上所述，这些发现表明bL31c定位于叶绿体核糖体，并参与叶绿体翻译。bL31c的缺陷特异性地导致PSI亚基翻译的最严重缺陷，这与观察到的光系统组装异常相关。

为了进一步研究bL31c如何参与叶绿体翻译，我们使用谷胱甘肽-S-转移酶（GST）pull-down实验鉴定其相互作用蛋白。重组的GST-bL31c（不含信号肽）和GST（阴性对照）与叶绿体蛋白提取物孵育，通过GST琼脂糖珠免疫沉淀并进行SDS-PAGE分析。提取出的特定条带通过质谱分析，鉴定出13个候选蛋白，其标准化丰度大于1×10^8。在排除了非叶绿体定位的蛋白、核糖体蛋白和高丰度的污染物后，我们聚焦于两个候选蛋白：RAB8D和MAP1C。为了验证这些相互作用在体外，我们生成了重组的His-tagged RAB8D和MAP1C蛋白进行GST pull-down实验。结果显示，只有RAB8D与bL31c特异性相互作用，而MAP1C则没有（图S7B）。为了进一步确认bL31c与RAB8D在体内相互作用，我们在烟草叶中进行了萤火虫荧光素酶互补（LUC）实验。当bL31c-nLUC和cLUC-RAB8D共表达时，检测到强烈的LUC信号，而阴性对照（bL31c-nLUC和cLUC-PetA）则未检测到信号。此外，拟南芥中的共免疫沉淀（Co-IP）实验显示，bL31c在互补的rab8d-2植株中能高效共沉淀RAB8D-GFP，表明bL31c能够与RAB8D在体外和体内相互作用。

bL31c广泛存在于细菌、蓝藻和高等植物的叶绿体中。为了研究这些蛋白的进化保守性和生物学功能，我们分析了它们的序列和功能关系。bL31同源蛋白的系统发育分析显示，从细菌到高等植物，这些蛋白的序列保持保守，树状图阐明了细菌、蓝藻和不同植物物种之间的进化关系。作为参考，大肠杆菌中的bL31被指定为NP 418371.1，而蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803中的bL31s被指定为WP 010871950.1。序列比对进一步显示，拟南芥的bL31c和大肠杆菌的bL31均含有C端延伸，而蓝藻的bL31s则没有，这表明这些同源蛋白之间可能存在功能上的分歧。我们还分析了RAB8D同源蛋白在不同物种中的进化保守性。系统发育树显示，EF-Tu延伸因子，包括蓝藻中的sEF-Tu、大肠杆菌中的TUFA和TUFB，以及拟南芥中的RAB8D，在进化上具有保守性。这促使我们研究EF-Tu与bL31同源蛋白的相互作用是否具有进化上的保守性。由于TUFA和TUFB仅在C端存在差异，我们使用TUFA作为大肠杆菌EF-Tu的代表进行结合实验。GST pull-down实验显示，大肠杆菌的bL31并不与TUF相互作用。相反，尽管植物bL31c和蓝藻bL31s在结构上存在差异，但sEF-Tu与bL31s的相互作用在蓝藻中是保守的。这表明，尽管EF-Tu的GTP酶活性在所有物种中都是普遍保守的，但其核糖体相互作用伙伴在不同谱系中发生了分化。Ka/Ks分析显示，bL31同源蛋白在进化过程中保持功能保守性，并受到弱正选择。此外，bL31s由于其较高的突变率，可能获得了与bL31不同的功能。

由于bL31c与RAB8D相互作用，这两种蛋白可能在叶绿体翻译中协同作用。我们假设bL31c的敲低可能干扰RAB8D介导的生物学功能，导致黄化和生长迟滞，因此rab8d突变体可能表现出与bl31c突变体相似的表型。为了验证这一点，我们比较了bl31c和rab8d突变体的生长表型。根据之前的报道，RAB8D敲低突变体（rab8d-1和rab8d-2）在培养基上生长时表现出黄化，这与预期的bl31c-2突变体相似（图S11A）。当在土壤中生长时，rab8d-1和rab8d-2的生物量与bl31c相似，并显著低于野生型（图6A）。此外，rab8d-1的RAB8D表达水平低于rab8d-2，表现出更严重的生长缺陷（图6A和S11B）。我们随后测量了rab8d突变体的叶绿素荧光参数。与bl31c突变体类似，rab8d突变体在逐渐增加的光照强度下表现出降低的Y(II)和ETRII，同时伴随显著增加的NPQ（图6B）。此外，PSI功能在rab8d突变体中也受损，表现为Y(NA)值为负和Y(ND)值显著增加（图6C），这与bl31c突变体中观察到的PSI缺陷相吻合。

由于bL31c和RAB8D在叶绿体翻译中协同作用，我们推测翻译延伸缺陷可能导致光系统组装异常。为了验证这一点，我们通过处理野生型植物使其模拟翻译延伸缺陷，使用氯霉素（Cm^R），这是一种阻断70S核糖体沿mRNA移动的抑制剂。处理后，野生型植物（WT with Cm^R）表现出类似于bl31c和rab8d突变体的黄化和生长迟滞表型（图6G）。此外，BN-PAGE分析显示，WT with Cm^R植物也表现出PSI-LHCI-LHCII超复合物的升高（图6H和6I）。这些结果确认了叶绿体翻译延伸缺陷足以导致PSI-LHCI-LHCII超复合物的异常积累。

我们发现，bL31c是拟南芥中EF-Tu延伸因子的结合位点。这种相互作用在蓝藻中是保守的，但在大肠杆菌中则不是。为了研究进化动态，我们进行了Ka/Ks分析，比较了bL31s、bL31和bL31c（图S10）。bL31s的Ks值高于bL31，表明bL31s积累了更多的突变并以更快的速度进化。然而，Ka/Ks比值小于1，表明该基因在功能上保持保守，并受到弱正选择。这一结果提示，由于其较高的突变率，bL31s可能获得了与bL31不同的功能。

bL31c作为叶绿体核糖体蛋白，其在翻译延伸中的作用具有广泛的效应。我们通过多种方法验证了这一结论，包括qPCR、RNA-seq、核糖体测序（ribo-seq）和蛋白质组分析。这些分析显示，核编码的光系统基因在转录组、翻译组和蛋白质组中表现出一致的变化，而叶绿体编码的亚基则表现出从转录组到蛋白质组的渐进性减少。这一现象表明，bL31c对叶绿体翻译具有广泛的影响，特别是在叶绿体编码的光系统亚基上。叶绿体编码的光系统基因在突变体中表现出略微升高的RNA水平，而大多数叶绿体编码的光系统基因保持与野生型相似的核糖体占有率。然而，PsaA、PsaB和其他几个亚基的RPKM值降低，这表明bL31c的缺陷特异性地影响了PSI亚基的翻译。蛋白质组分析进一步显示，光系统亚基的丰度普遍降低，其中PSI亚基的减少最为严重，尤其是核心亚基PsaA和PsaB。这些结果表明，尽管bL31c的缺乏广泛影响叶绿体翻译，但PSI生物合成尤为脆弱，这可能与其核心亚基的合成受损有关。

在本研究中，我们还发现，bL31c与RAB8D的相互作用是其在叶绿体翻译中发挥作用的关键。通过使用GST pull-down实验，我们验证了bL31c与RAB8D在体外的相互作用，而与MAP1C的相互作用则未被观察到。此外，通过在烟草叶中进行萤火虫荧光素酶互补实验，我们确认了bL31c与RAB8D在体内的相互作用。这些结果表明，bL31c与RAB8D在翻译过程中协同作用，共同影响叶绿体翻译和光系统生物合成。在进化上，我们发现bL31c和RAB8D的相互作用在蓝藻中是保守的，但在大肠杆菌中则不是。这提示，尽管EF-Tu的GTP酶活性在所有物种中都是普遍保守的，但其核糖体相互作用伙伴在不同谱系中发生了分化。

我们还发现，bl31c敲低突变体的表型是由叶绿体翻译缺陷引起的。通过分析bl31c和rab8d突变体的光系统组装情况，我们发现这些突变体均表现出PSI-LHCI-LHCII超复合物的异常积累。此外，LHCII的磷酸化水平在这些突变体中显著升高。这些发现共同支持了bL31c和RAB8D在叶绿体翻译和光系统生物合成中的协同作用。这表明，bL31c不仅是叶绿体核糖体的一个结构组分，还作为翻译延伸的关键调控因子发挥作用。值得注意的是，尽管拟南芥的bL31c与大肠杆菌的bL31在C端存在延伸，但它们在功能上保持保守，而蓝藻的bL31s则表现出不同的功能特征。这提示，bL31c可能保留了其蓝藻同源蛋白bL31s的祖先功能，即与延伸因子相互作用。

在bl31c突变体中，PSI和PSII的亚基丰度均下降，这与光合活性的降低相关。具体而言，PSII的Y(II)、ETRII和Pm值均下降，而NPQ值显著升高。PSI的Pm值也显著降低，表明PSI功能受损。这些变化可能与PSI的电子代谢效率降低有关。PSI的Pm值降低，可能是因为其核心亚基的合成受损，而PSII的D1亚基则经历快速周转以防止光损伤。PSI亚基的稳定性远高于PSII，这使得PSI的核心亚基翻译更容易受到干扰。因此，PSI的合成可能比其他光系统亚基更易受到bL31c缺陷的影响。

综上所述，叶绿体翻译延伸缺陷会破坏光合蛋白的合成，导致PSI功能受损。为了补偿这种缺陷，LHCII从PSII中解离并与PSI结合，形成PSI-LHCI-LHCII超复合物，从而增强PSI的光捕获能力和光合能力。这一现象表明，PSI和PSII之间的功能失衡可能是一种适应性策略，以维持光合系统在不同光照条件下的平衡。然而，这种补偿机制可能并不总是有效，特别是在bL31c突变体中，由于PSI的核心亚基翻译受损，导致其功能严重受限。因此，尽管PSI的电子传递速率和Y(ND)值升高，但其最大P700氧化信号Pm值显著降低，表明PSI功能的严重缺陷。这种现象可能与PSI中电子代谢效率的降低有关，因为PSI的PQ池在突变体中表现出过度还原。

在本研究中，我们通过多种实验方法揭示了bL31c在叶绿体翻译中的关键作用及其与RAB8D的相互作用。这些发现不仅有助于理解叶绿体翻译机制，还为研究光合复合物的组装和调控提供了新的视角。我们发现，bL31c和RAB8D的相互作用在蓝藻中是保守的，但在大肠杆菌中则不是，这表明翻译监视机制在不同谱系中经历了适应性进化。此外，我们还发现，bL31c在高等植物中可能保留了其祖先功能，即作为EF-Tu的结合位点。这些结果为理解叶绿体翻译与光合复合物组装之间的动态协调提供了重要线索，并揭示了翻译延伸因子在维持光合系统平衡中的关键作用。