hfCas12Max介导的靶向整合能够将含有山羊来源UCOE的基因整合到可访问的染色质区域，从而增强重组乳铁蛋白的稳定表达

《Journal of Genetics and Genomics》：hfCas12Max-mediated targeted integration at accessible chromatin regions with a goat-derived UCOE enhances stable recombinant lactoferrin expression

本研究通过ATAC-seq鉴定山羊乳腺上皮细胞中15个高可及性区域，其中3个支持稳定转基因表达。发现源自SF3B1-COQ10B间区的山羊特异性UCOE（含高GC含量CpG岛），利用hfCas12Max实现大片段精准整合，构建出hLTF稳定表达的山羊模型，证实UCOE通过维持开放染色质抑制转录沉默，为乳制品工程提供新工具。

　　这项研究聚焦于通过优化基因表达机制，提高转基因山羊乳腺生物反应器中人类乳铁蛋白（hLTF）的生产效率。乳铁蛋白是一种重要的免疫蛋白，天然存在于牛和山羊的乳汁中，但其含量较低。由于乳铁蛋白在婴儿配方奶中的高成本，因此开发一种更高效、更经济的生产系统成为迫切需求。乳腺生物反应器作为一种有前景的技术平台，能够通过乳腺组织的特异性表达，实现对重组蛋白的高效生产，这得益于乳腺组织具备正常的翻译后修饰能力，并且能够进行大规模、低成本的生产。

然而，转基因研究中面临的一个主要挑战是维持长期稳定的转基因表达。许多转基因在发育过程中或在不同世代之间会出现表达水平下降甚至完全沉默的现象，这种现象被称为转基因沉默。这一问题通常归因于位置效应，包括整合位点的影响和转基因元件的表观遗传沉默。其中，启动子甲基化是抑制基因转录的一个常见机制。例如，Grant等人的研究表明，启动子甲基化会显著抑制小鼠内源性乳铁蛋白基因的转录。同样，在转基因动物中，外源基因的启动子也可能受到甲基化的影响，从而导致基因沉默。这种由启动子甲基化引起的沉默机制可能也适用于hLTF转基因，尽管目前尚无直接证据表明hLTF转基因沉默与启动子甲基化之间存在明确联系。值得注意的是，乳铁蛋白在乳腺组织中的表达依赖于一种激素激活的表观遗传环境。转基因的随机整合可能会干扰有效激素响应条件的建立，导致异常的启动子甲基化，从而抑制hLTF的表达。

为了解决这些挑战，需要采取多方面的策略。首先，应识别具有高染色质可及性的“安全港”位点，以确保转基因的稳定表达。其次，整合能够抵抗表观遗传沉默的cis作用元件至关重要。这些元件应维持启动子区域的开放染色质状态，并促进激素响应转录因子（如STAT5）的及时调控，从而确保在泌乳期间的持续稳定转录。此外，选择合适的整合位点和调控元件后，使用适当的基因编辑工具对于生成转基因动物至关重要，因为即使是最精心设计的靶点和元件，也需要精准的工具来进行有效的基因组修饰。

目前，CRISPR/Cas9系统是该领域最常用的基因编辑技术。然而，它存在一些显著的局限性，包括较高的脱靶效应风险以及在整合大片段DNA时的效率不足。这些限制凸显了对更先进基因编辑工具的需求。近年来，hfCas12Max系统作为一种有前景的替代方案，因其高保真度、更高的编辑效率以及显著降低的脱靶风险而受到关注。与其他Cas12家族成员（如Cas12a）类似，hfCas12Max能够生成适合大片段插入的黏性末端，从而为转基因动物的精准基因组编辑提供了一种可行的工具。实验研究表明，与Cas9生成的钝性末端相比，Cas12a生成的黏性末端能够通过互补配对提高DNA断裂的对齐精度，从而减少非同源末端连接（NHEJ）导致的随机插入或缺失（Indels），为同源定向修复（HDR）提供更稳定的模板对接条件。在使用环状单链DNA（cssDNA）模板时，Cas12a在多个基因组位点的HDR效率均高于SpCas9。相比之下，Cas9的HDR效率受到其生成钝性末端的限制，并且由于NHEJ通路更为活跃，通常在DNA修复过程中占据主导地位。尽管通过抑制NHEJ因子（如XRCC4）或过表达HDR增强因子（如CtIP和MRE11）可以提高Cas9介导的HDR效率，但这些方法增加了操作复杂性，并可能引入意想不到的细胞效应。相比之下，生成黏性末端的工具，如hfCas12Max，因其内在的分子结构优势，简化了这一过程。然而，目前尚无直接证据支持hfCas12Max在促进基于HDR的大片段DNA整合方面的显著优越性。

基于上述背景，本研究旨在开发一种高效的山羊乳腺生物反应器，用于hLTF的生产。我们对泌乳期和干奶期的山羊乳腺上皮细胞（GMECs）进行了ATAC-seq和RNA-seq分析，以全面绘制泌乳期间高染色质可及性的区域，从而识别适合外源基因整合的基因组位点。此外，通过筛选全基因组范围内的高染色质可及性区域和管家基因的双向启动子元件，我们鉴定了山羊特有的UCOE元件。利用hfCas12Max系统靶向ROSA26位点，我们成功生成了整合UCOE调控元件的hLTF转基因山羊。这一研究不仅为高表达hLTF的转基因山羊提供了宝贵的遗传资源，还为乳腺生物反应器在畜牧业中的应用提供了重要的策略。

在研究过程中，我们还对山羊乳腺上皮细胞的染色质可及性进行了详细表征。我们从泌乳期（产后60天）和干奶期（产前60天）的健康萨能奶山羊中分离乳腺组织，每个时间点收集五个重复样本。在确认细胞纯度后，我们选择了三个高质量样本进行高通量测序（图S1）。随后，我们对这些样本进行了ATAC-seq和RNA-seq分析（图1A）。ATAC-seq每样本平均产生1.12亿原始读数，映射率高达79.98%（图1B）。这些数据表明，我们能够有效地识别出山羊乳腺组织中具有高染色质可及性的区域，为转基因的稳定整合提供了基础。

我们进一步在山羊乳腺组织中发现了三个能够支持稳定转基因表达的高可及性区域。其中，一个特别引人注目的发现是在SF3B1与COQ10B之间的基因间区域中鉴定出一个源自山羊的通用染色质开放元件（UCOE）。该UCOE具有较高的GC含量（65%）和CpG岛富集特征。实验结果表明，该UCOE能够增强hfCas12Max介导的大片段DNA整合，并在GMECs中维持hLTF的高水平表达。这一发现为防止转基因沉默提供了新的思路，同时也揭示了CpG岛含有的UCOE在调控基因表达中的重要作用。

随后，我们通过精确编辑技术，将UCOE-hLTF cassette整合到高可及性的基因组位点，并通过体细胞核移植技术生成了转基因山羊。这一过程未检测到明显的脱靶效应，表明我们的方法具有较高的精准性和安全性。我们的研究流程整合了染色质可及性分析、UCOE发现和精确编辑技术，展示了UCOE在促进转基因表达稳定性中的关键作用。这一成果不仅为提高重组蛋白的生产效率提供了有价值的工具，也为培育高乳铁蛋白含量的奶山羊提供了支持，同时推动了对染色质、调控元件与转基因之间相互作用的理解。

此外，本研究还探讨了UCOE在不同物种中的应用潜力。尽管UCOE在哺乳动物细胞中已被广泛用于维持转基因的长期稳定表达，但针对畜牧业物种（如山羊）的UCOE研究仍较为有限。因此，本研究的意义不仅在于解决当前的转基因表达问题，还在于为未来在其他动物物种中开发类似的UCOE元件提供参考。通过系统地分析山羊乳腺组织的染色质可及性，我们能够识别出具有潜力的整合位点，并进一步优化转基因表达系统，使其在实际应用中更加高效和可靠。

在实验设计方面，我们采用了一系列严格的步骤以确保研究的科学性和可重复性。首先，我们从健康山羊中分离乳腺组织，并通过伦理审查确保实验的合规性。随后，我们对组织进行了清洗、消毒和培养处理，以获得高质量的乳腺上皮细胞。我们选择了三个高纯度的样本进行后续的高通量测序分析，并对这些样本进行了ATAC-seq和RNA-seq实验，以全面了解染色质状态和基因表达模式。ATAC-seq结果不仅揭示了山羊乳腺组织中高可及性的区域，还为后续的基因编辑操作提供了重要依据。

我们还对转基因的表达模式进行了深入分析，以评估UCOE对hLTF表达的促进作用。实验结果显示，整合UCOE的hLTF转基因在乳腺组织中能够维持高水平的表达，且在不同世代之间表现出相对稳定的遗传特性。这表明，UCOE不仅能够减少启动子甲基化，还能维持开放的染色质状态，从而有效防止转基因沉默。此外，我们通过精确编辑技术，将UCOE-hLTF cassette整合到高可及性的基因组位点，并通过体细胞核移植技术成功生成了转基因山羊。这一过程未检测到明显的脱靶效应，进一步验证了我们方法的精准性和安全性。

在实际应用中，本研究的成果具有重要的意义。首先，它为提高hLTF在山羊乳腺组织中的表达水平提供了新的策略，有助于实现更高产量的重组蛋白生产。其次，它为奶山羊的遗传改良提供了支持，使乳铁蛋白成为乳汁中的一种可利用的生物活性成分。此外，该研究还揭示了染色质可及性、调控元件和转基因之间的相互作用机制，为未来的分子育种研究提供了理论依据和技术支持。

综上所述，本研究通过整合染色质可及性分析、UCOE发现和精确编辑技术，为提高转基因山羊的重组蛋白生产效率提供了有效的解决方案。这一成果不仅有助于推动畜牧业中的生物技术应用，也为相关领域的基础研究提供了新的视角。未来，随着对染色质调控机制的进一步理解，我们可以期待更多类似的策略被应用于其他动物物种，从而实现更高效、更稳定的转基因表达系统。同时，随着基因编辑技术的不断进步，我们也有望开发出更加精准、安全的工具，以应对当前基因编辑过程中存在的各种挑战。