从人脐带血中分离出的Lin?CD45?CD133+细胞在体外生成去核红细胞

《Stem Cells International》：Generation of Enucleated Erythrocytes From Lin?CD45?CD133+ Cells Isolated From Human Umbilical Cord Blood In Vitro

基于脐带血Lin?CD45?CD133?细胞体外诱导分化，成功建立红细胞生成系统，通过血清无培养基及多因子协同作用，分化细胞呈现典型红系特征，并验证其功能指标达标。

　　在当前的医疗体系中，血液供应不足已成为一个日益严重的问题。尤其是在许多地区，由于献血者的数量有限，而对血液的需求却不断上升，导致血库时常面临供不应求的困境。这种供需失衡不仅影响了临床治疗的及时性，还可能对患者的生命安全造成威胁。为了解决这一问题，科学家们致力于探索体外生产红细胞（RBCs）的方法，以期能够缓解血库压力，为临床提供稳定的血源。近年来，研究者发现人类脐带血（UCB）中存在一种具有类似胚胎干细胞（ESCs）特性的细胞群体，被称为非常小的胚胎样干细胞（VSELs）。这些细胞在特定条件下可以被诱导分化为多种类型的细胞，包括红细胞和血小板，为体外红细胞生产提供了新的可能性。

本研究的主要目标是通过体外培养的方式，从人类脐带血中分离出Lin^?CD45^?CD133⁺细胞，并将其诱导分化为成熟的红细胞。Lin^?CD45^?CD133⁺细胞是一类具有多向分化潜能的细胞，它们不仅能够表达胚胎干细胞相关的转录因子Oct-4和Nanog，还表现出无限增殖和自我更新的能力。这些特性使它们成为一种极具潜力的干细胞来源，有望用于再生医学、组织工程以及临床治疗等多个领域。由于其来源安全、伦理争议较少，相较于传统的胚胎干细胞，Lin^?CD45^?CD133⁺细胞在未来的红细胞生产中具有广阔的应用前景。

为了实现这一目标，研究人员首先从新鲜的脐带血中分离出单核细胞（MNCs），然后利用磁珠分选技术（MACS）进一步筛选出Lin^?CD45^?CD133⁺细胞。该方法相比传统的流式细胞分选技术（FACS）更为简便，且对操作人员的技术要求较低，适合在普通实验室中进行。通过流式细胞术、免疫细胞化学（ICC）、实时荧光定量PCR（RT–PCR）等手段，研究人员确认了这些细胞的生物学特征，包括其表达的胚胎干细胞相关标志物和细胞形态学特征。研究还发现，这些细胞在培养过程中逐渐失去了CD133的表达，并开始表达CD45，表明它们正在向造血细胞的方向分化。

在体外培养过程中，研究人员采用了一种分阶段的培养策略。第一阶段（第0至13天）使用了无血清培养基，并加入了干细胞因子（SCF）、白细胞介素-3（IL-3）、促红细胞生成素（EPO）和他克莫司（FK506）等细胞因子，以促进红细胞的分化。第14天开始，研究人员加入了5%的脐带血自体血浆，以进一步优化红细胞的成熟过程。在培养的后期（第18至23天），研究人员停止添加细胞因子，仅依靠自体血浆维持细胞生长。这种分阶段的培养方法不仅有助于提高红细胞的产量，还能够促进细胞的成熟和功能完善。

通过电镜观察和流式细胞术分析，研究人员发现，Lin^?CD45^?CD133⁺细胞在体外培养过程中逐渐表现出红细胞的典型形态，如双凹盘状结构，并且细胞内的ATP和2,3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG）水平与正常红细胞相似，表明这些细胞在功能上具备与天然红细胞相当的潜力。此外，研究还发现，随着培养时间的延长，CD71⁺、CD235a⁺和CD240⁺等红细胞特异性标志物的表达比例逐步上升，其中CD240⁺的表达在第20天达到峰值，这进一步支持了这些细胞能够被成功诱导为红细胞的观点。

然而，尽管本研究取得了一定的进展，仍然存在一些局限性。首先，目前的研究仅基于三次实验，样本量较小，实验的重复性和可扩展性仍需进一步验证。其次，虽然研究人员检测了培养红细胞中的ATP和2,3-DPG含量，但并未评估这些红细胞的携氧能力和生命周期，这对于评估其临床应用价值至关重要。此外，研究中缺乏对照组，例如同时诱导脐带血来源的Lin^?CD45^?CD133⁺细胞和CD34⁺细胞进行比较，以进一步明确这两种细胞在红细胞生产中的相对优势。同时，目前的培养体系仍然依赖于昂贵的细胞因子和培养基，这在大规模生产红细胞时可能成为成本方面的障碍。

为了克服这些挑战，研究者提出了一些可能的改进方向。例如，利用大规模生物反应器进行红细胞的体外培养，可以显著降低生产成本，提高红细胞的产量。此外，优化培养条件，如调整细胞因子的浓度、培养时间以及血浆的添加方式，也可能是提升红细胞生产效率的关键。同时，探索更加经济高效的培养基配方，将有助于推动这一技术的商业化和临床应用。

从伦理角度来看，Lin^?CD45^?CD133⁺细胞来源于脐带血，这种来源不仅具有较高的安全性，还避免了使用胚胎干细胞可能引发的伦理争议。因此，该方法在伦理层面更具优势，适合用于未来的临床转化研究。同时，由于这些细胞来源于人体，它们的免疫排斥反应风险较低，更易于应用于临床治疗。

此外，研究人员还发现，加入自体血浆可以显著提高红细胞的去核效率，从而生成更多成熟的、无核的红细胞。这一发现为未来开发更加高效的红细胞生产体系提供了重要的线索。在实际应用中，这一技术不仅可以用于满足临床对红细胞的需求，还可能用于解决特定患者群体的输血问题，如稀有血型患者的血液供应不足、Rh阴性血型患者的血源短缺等。

综上所述，本研究成功建立了一种从人类脐带血中分离并诱导分化为红细胞的体外培养体系，为红细胞的体外生产提供了新的思路和方法。尽管目前仍面临一些技术上的挑战，但随着相关技术的不断进步和研究的深入，这一方法有望在未来成为解决血液短缺问题的重要手段。同时，研究也强调了进一步优化培养条件、扩大实验规模以及开展更多功能评估的重要性，以确保最终生成的红细胞在临床应用中具有足够的安全性和有效性。