Prime Editing介导的抑制性tRNA安装实现疾病无关性基因组编辑新突破

《Nature》：Prime editing-installed suppressor tRNAs for disease-agnostic genome editing

本研究针对传统基因编辑技术需为每种突变开发新疗法的局限性，开发了名为PERT的疾病无关性治疗策略。研究人员通过Prime Editing将内源性tRNA转化为优化的抑制性tRNA，成功在多种疾病模型中恢复蛋白质功能，为治疗由无义突变引起的遗传病提供了单次治疗通用方案。

　　

遗传疾病困扰着全球数亿患者，其中约24%的致病突变属于无义突变，这些突变会导致蛋白质合成提前终止。虽然基因编辑技术如碱基编辑和Prime Editing能够精确纠正致病突变，但每种突变都需要开发特定的治疗方案，这为治疗数千种遗传病带来了巨大挑战。

传统基因编辑方法需要为每个突变设计特定的编辑策略，而人类已知的致病突变超过20万种，开发、生产和监管数千种个体化治疗方案几乎不可行。无义突变导致的翻译提前终止为其治疗提供了独特机会，因为这类突变可以通过抑制性tRNA（sup-tRNA）实现通读，理论上同一sup-tRNA可以治疗多种不同基因中的同类无义突变。

然而，现有sup-tRNA治疗方法面临两大挑战：需要终身给药，以及为达到治疗效果往往需要过量表达sup-tRNA，这可能干扰全局翻译并产生毒性。此外，人们对sup-tRNA效力的决定因素了解不完全，限制了其治疗效果。

为解决这些问题，David R. Liu团队开发了Prime Editing介导的提前终止密码子通读（PERT）策略。该策略利用Prime Editing技术将冗余的内源性tRNA基因永久转化为优化的sup-tRNA，实现了疾病无关性的治疗方法。

研究团队采用了几项关键技术方法：通过高通量筛选评估了所有418个人类高置信度tRNA变体；利用Prime Editing技术在内源性tRNA位点进行精确编辑；使用AAV9载体进行体内递送；建立了多种疾病细胞模型（Batten病、Tay-Sachs病、囊性纤维化等）和小鼠疾病模型（Hurler综合征）；通过蛋白质组学和转录组学分析评估安全性。

低拷贝数限制sup-tRNA效率

研究人员首先尝试将内源性tRNA-Gln-CTG-6-1和tRNA-Arg-CCG-2-1转化为sup-tRNA，发现虽然在高表达报告基因条件下能观察到通读，但在单拷贝报告基因条件下效果有限。这表明需要寻找在低拷贝数下仍具有足够效力的sup-tRNA。

筛选Prime Editing安装的sup-tRNA

研究团队设计了大规模筛选实验，通过Prime Editing将所有人418个高置信度tRNA基因的反密码子分别改为CUA、UCA和UUA，对应识别TAG、TGA和TAA终止密码子。筛选发现精氨酸、亮氨酸、酪氨酸和丝氨酸tRNA骨架能够通读TAG终止密码子，而亮氨酸和精氨酸tRNA骨架能通读TGA终止密码子。

外源启动子筛选

研究人员测试了三种不同启动子驱动sup-tRNA表达的效果，发现外源启动子可能阻碍许多sup-tRNA的正确表达。亮氨酸TAA sup-tRNA在hU6启动子下表现最强，而酪氨酸GTA sup-tRNA在minU6或无启动子条件下表现最佳。

sup-tRNA前导序列和终止序列

通过系统分析tRNA前导序列和终止序列的影响，研究发现许多不同的前导序列都能支持强大的sup-tRNA活性，而终止序列对sup-tRNA活性至关重要，直接相邻的5T终止子性能优于大多数内源性终止序列。

sup-tRNA的饱和突变

研究人员对选定的sup-tRNA进行饱和突变筛选，发现大多数突变会降低sup-tRNA性能，但一部分单核苷酸变异和配对碱基替换能提高sup-tRNA性能。在tRNA-Leu-TAA-4-1中有益的突变也适用于相关家族成员。

工程化最优Leu-TAA sup-tRNA

选择tRNA-Leu-TAA家族进行进一步工程化，通过组合多个反密码子邻近突变，产生了比仅反密码子替换的sup-tRNA高5倍的GFP蛋白产量，达到野生型GFP的35%。

优化sup-tRNA安装

研究人员设计了包含17,280个epegRNA的文库，系统测试了间隔序列变体、PBS长度、RTT长度和19个突变变体的组合。PE6c在所有测试条件下产生最高的平均编辑效率，而包含MLH1dn能提高大多数变体的编辑效率。

脱靶编辑分析

通过两种独立方法评估PERT的脱靶编辑：特异性位点深度测序和全基因组脱靶筛选。在优化的epegRNA条件下，未检测到显著的脱靶编辑事件，证实了Prime Editing的高序列特异性。

PERT对转录组的影响

RNA-seq分析显示，将内源性tRNA-Leu-TAA-1-1基因转化为工程化sup-tRNA后，没有差异表达基因，表明没有明显的应激反应。定量PCR分析28个不同tRNA基因家族表达，也未发现显著差异。

PERT对蛋白质组的影响

质谱分析检测天然终止密码子通读，发现除了报告基因GFP外，没有检测到任何蛋白质在天然TAG终止密码子后的翻译肽段。目标离子质谱对69个高丰度TAG终止蛋白质的分析也仅发现一个可能的通读肽段，但其丰度没有显著差异。

治疗相关PTC的拯救

研究人员在HEK293T细胞中模拟了引起Batten病、Tay-Sachs病和Niemann-Pick病C1型的已知人类致病性PTC。使用相同的Prime Editing试剂转化内源性基因组tRNA-Leu-TAA-1-1位点，在四种TPP1和HEXA致病性PTC模型中实现了显著（17-70%）的酶活性恢复。

体内报告系统中的PERT

通过新生鼠脑室内注射AAV9载体，将Prime Editing组分和eGFP报告基因递送到野生型C57/BL6小鼠体内。3周后分析显示，TAG sup-tRNA平均编辑效率为11%，TGA sup-tRNA为23%，相对蛋白产量分别达到24%和26%。

Hurler综合征体内模型的PERT

在Hurler综合征小鼠模型（Idua^W392X）中，PERT治疗导致IDUA酶活性显著恢复，疾病病理几乎完全拯救。组织学分析显示，小脑Purkinje细胞和丘脑神经元的空泡化在治疗组中得到解决，肝脏、心脏和脾脏的泡沫细胞积累也消失。

本研究开发的PERT策略将持久性一次性治疗的基因组编辑潜力与sup-tRNA的广泛适用性相结合。通过高通量评估数千种变体，研究人员鉴定了能够通读约32%所有可能无义突变的sup-tRNA，其中tRNA-Leu-TAA-1-1表现出最高的基线通读效率。

该研究证实，通过Prime Editing将单个内源性基因组tRNA基因转化为sup-tRNA对全局翻译结果的干扰可能小于外源过表达或递送sup-tRNA的先前方法。研究人员在培养细胞或小鼠中未观察到PERT的任何明显毒性，转录组没有变化，蛋白质组质谱也未检测到天然终止密码子通读。

尽管直接DNA水平纠正致病突变仍然是精准遗传医学最直接的方法，但目前开发、满足监管要求和生产许多基因编辑制剂所需的大量努力凸显了等位基因无关和疾病无关方法（如PERT）的重要性。通过使单一治疗方法能够解决广泛的无义突变相关疾病，PERT代表了向更大患者群体提供治疗性基因组编辑的重要进展。

该研究的发现为开发疾病无关性治疗策略奠定了基础，其中单一物质组成可能为患有不同遗传病的患者提供一次性治疗。例如，大约8,000名囊性纤维化患者、25.2万名Stargardt病患者、3.1万名苯丙酮尿症患者和4.35万名杜兴氏肌营养不良症患者原则上可以在进一步优化后用常见的PERT Prime Editing制剂进行治疗。