肝细胞线粒体NAD+含量是肝脏再生的关键限制因素

《Nature Metabolism》：Hepatocyte mitochondrial NAD+ content is limiting for liver regeneration

本研究聚焦于肝细胞线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）在肝脏再生中的核心作用。研究人员通过构建Slc25a51基因敲除和过表达小鼠模型，结合部分肝切除（PHx）技术，发现线粒体NAD+转运蛋白SLC25A51是决定肝细胞线粒体NAD+浓度的关键因子。研究表明，特异性提升肝细胞线粒体NAD+池足以显著促进肝脏再生，其效果与系统性补充NAD+前体相当。这一发现不仅阐明了NAD+前体发挥治疗作用的细胞器特异性机制，也为靶向线粒体代谢以改善肝脏再生能力提供了新的理论依据和治疗策略。

　　

在生物医学研究领域，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）作为一种至关重要的辅因子，参与细胞能量代谢、DNA修复和信号转导等多种生命过程。补充NAD⁺前体已被证明在多种疾病模型中可以改善代谢和功能，但其具体的作用机制仍不明确。一个核心的挑战在于，NAD⁺遍布于每个细胞及其各种亚细胞结构中，使得研究人员难以精确锁定其发挥功效的关键位点。肝脏具有强大的再生能力，部分肝切除（PHx）后，肝脏能够快速恢复其原有体积和功能。先前的研究表明，系统性补充NAD⁺前体可以促进肝脏再生，然而，究竟是哪个细胞器、哪种细胞内的NAD⁺池在其中扮演了决定性角色，一直是个悬而未决的问题。

近期，线粒体NAD⁺转运蛋白SLC25A51（也称为MCART1）的发现，为操纵和研究特定细胞类型的线粒体NAD⁺池提供了独特的机遇。发表在《Nature Metabolism》上的这项研究，正是利用这一契机，深入探究了肝细胞线粒体NAD⁺在肝脏再生过程中的核心地位。

为了回答上述问题，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究构建了Slc25a51基因敲除（杂合子，Slc25a51^+/-）和肝细胞特异性过表达（通过AAV8病毒载体介导）的小鼠模型。核心动物实验是经典的两分之三部分肝切除手术，用以评估肝脏再生能力。研究团队通过酶学方法、液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术精确测量了组织及亚细胞水平（通过差速离心法分离线粒体，并辅以稳定同位素标记SILEC技术）的NAD⁺及相关代谢物含量。此外，还利用高分辨率呼吸测定仪（Oroboros O₂k）评估了线粒体呼吸功能，并通过组织学（H&E和Ki-67染色）、免疫印迹、转录组学和蛋白质组学等多组学技术，全面分析了肝脏再生的表型及相关分子通路。

Slc25a51单倍体不足改变包括肝脏在内的组织线粒体NAD⁺含量

研究人员首先证实SLC25A51在体内的重要性。他们发现Slc25a51纯合缺失会导致胚胎致死，表明该基因是必需的。尽管Slc25a51^+/-杂合子小鼠的肝脏Slc25a51 mRNA表达量下降约50%，但其外观、体重、肝脏重量、血糖和血乳酸水平均正常。

关键发现在于，尽管肝脏总NAD⁺浓度未变，但从Slc25a51^+/-小鼠多个组织（包括肝脏、心脏和棕色脂肪组织）分离出的线粒体中，NAD⁺浓度均显著降低。代谢组学分析进一步证实，Slc25a51杂合性足以降低线粒体内NAD⁺及多种相关代谢物的含量。研究团队还通过一系列细胞实验（包括使用线粒体靶向的NAD⁺生物传感器和基于线粒体靶向PARP1催化结构域的NAD⁺转运检测体系）证明，SLC25A51，而非另一个候选蛋白SLC25A47，是肝细胞中线粒体NAD⁺含量的主要决定因子。

SLC25A51的部分缺失损害肝脏再生并轻度降低线粒体呼吸能力

由于Slc25a51^+/-小鼠表型相对温和，研究人员用部分肝切除（PHx）这一代谢应激模型来挑战它们。

结果显示，与野生型同窝小鼠相比，Slc25a51^+/-小鼠的肝脏再生速度更慢，表现为肝脏重量更低、肝细胞复制（有丝分裂指数）减少，并有甘油三酯（TG）积累增多的趋势。肝ATP含量在再生期间均下降，但基因型间无显著差异。总肝脏NAD⁺浓度在损伤后48小时均下降，且不受基因型影响；然而，从Slc25a51^+/-小鼠分离的肝线粒体中，NAD⁺含量在PHx后显著降低。线粒体呼吸功能测定显示，Slc25a51^+/-小鼠肝线粒体的复合物I（CI）依赖性呼吸和脂肪酸氧化（FAO）能力受损。这些数据支持肝细胞线粒体NAD⁺限制肝脏再生的模型。

肝细胞中SLC25A51的过表达增加线粒体NAD⁺，促进肝脏再生并维持损伤后线粒体呼吸能力

为了验证增加特定细胞类型的线粒体NAD⁺能否改善再生，研究人员使用腺相关病毒（AAV）在肝细胞中特异性过表达人源SLC25A51。

结果显示，过表达使肝脏SLC25A51转录本和蛋白水平提高约2-3倍，并导致线粒体NAD⁺预期性增加。使用NAD-SILEC技术进行的亚细胞分馏实验证实，过表达仅增加了线粒体NAD⁺，而未检测到胞质NAD⁺的变化。肝组织代谢组学显示ATP和其他核苷酸三磷酸盐增加，表明能量电荷升高。转录和蛋白质分析揭示过表达上调了PPAR信号通路以及与脂肪酸生物合成和代谢相关的因子。

在PHx实验中，与表达eGFP的对照组相比，SLC25A51过表达小鼠的肝脏再生显著改善，表现为肝脏重量、有丝分裂细胞和Ki-67阳性细胞百分比均显著增加。肝ATP、总NAD⁺和NADP⁺水平在再生期间下降，但过表达使其略有升高。线粒体NAD⁺和NADH水平因过表达而升高。从过表达肝脏分离的线粒体在再生组织中显示出复合物I、II和IV依赖性呼吸以及脂肪酸氧化的改善。相关分析表明，肝细胞复制速率和复合物I依赖性呼吸均与线粒体NAD⁺含量高度相关。

SLC25A51过表达促进脂肪酸代谢并减轻肝脏再生期间线粒体代谢物的耗竭

为了深入了解线粒体NAD⁺如何影响再生过程，研究人员进行了代谢组学和蛋白质组学分析。在整体肝脏水平，再生诱导的代谢物变化在SLC25A51过表达肝脏和eGFP对照组之间相似，许多差异源于切除肝脏的初始状态不同。蛋白质组学分析显示，在再生状态下，过表达肝脏与对照组几乎完全重叠，表明再生过程中的收敛。过表达肝脏未显示蛋白质乙酰化、PAR化或CD38表达的一致变化，但几种电子传递链组分的表达增加。参与脂肪酸生物合成的蛋白质在过表达肝脏中上调。从对照组肝脏分离的线粒体中，再生与许多代谢物的丢失相关；而在SLC25A51过表达肝脏的线粒体中，这些效应被减弱，并且一些在对照组中不受影响的代谢物反而增加。血浆代谢组学分析揭示了再生期间的变化，SLC25A51过表达小鼠的血浆中部分代谢物维持得更好。

本研究确立了SLC25A51是体内肝细胞线粒体NAD⁺池的主要决定因素。研究发现，肝细胞线粒体NAD⁺池的大小是肝脏再生能力的关键限制因素。即使总组织NAD⁺水平不变，线粒体NAD⁺的轻微降低也足以损害再生；反之，特异性增加肝细胞线粒体NAD⁺池就足以显著促进再生，效果与全身性NAD⁺前体补充相当。这表明NAD⁺前体发挥益处的机制可能在于提升了肝细胞线粒体这一特定区域的NAD⁺水平。

这一发现具有多重重要意义。首先，它明确了SLC25A51（而非SLC25A47）是肝脏等多种组织中线粒体NAD⁺的主要转运蛋白，且其功能缺失无法被有效补偿。其次，它将肝脏再生中NAD⁺的作用机制缩小至单一细胞类型（肝细胞）的单一亚细胞池（线粒体）。研究表明，在标准饲养条件下，肝细胞线粒体NAD⁺的适度变化仅产生轻微表型，但在如肝脏再生这样的应激下，其重要性则凸显出来。线粒体NAD⁺可能通过维持能量电荷、线粒体代谢物水平以及促进脂质代谢（特别是脂肪酸氧化）来支持再生。较高的线粒体NAD⁺水平可能使肝脏更好地应对再生过程中的代谢需求。

此外，该研究对NAD⁺代谢研究具有启示意义。由于线粒体NAD⁺可在不影响总细胞NAD⁺的情况下发生剧烈变化，标准的组织NAD⁺测量可能无法检测到线粒体NAD⁺缺乏。同样，补充剂可能增加总组织NAD⁺，但对线粒体水平影响甚微。这强调了在理解NAD⁺代谢时，需要考虑相关的细胞类型和亚细胞区室。

总之，这项研究揭示了肝细胞线粒体NAD⁺池在肝脏再生中的核心地位，并指出SLC25A51是调控该池的关键分子。这为开发靶向线粒体NAD⁺以改善肝脏再生和治疗相关疾病的新策略提供了坚实的理论基础。