阿巴拉契亚蝾螈皮肤新型抗菌肽的发现及其与皮肤微生物组的相互作用研究

《npj Biofilms and Microbiomes》：Novel antimicrobial peptides and peptide-microbiome crosstalk in Appalachian salamander skin

本刊推荐：为探索宿主防御肽与皮肤微生物组的相互作用机制，研究人员综合运用转录组学、蛋白质组学和微生物生态学技术，在三种阿巴拉契亚蝾螈皮肤中发现200余种候选抗菌肽(AMP)。研究发现皮肤肽组成可预测细菌群落结构，并鉴定出两种新型Cathelicidin肽(Pcin-CATH3/Pcin-CATH5)对多重耐药菌(ESKAPEE)具有显著抑制活性。该研究为微生物-免疫界面研究提供了新视角，对野生动物保护和新型抗菌药物开发具有双重意义。

　　

在全球两栖动物种群面临壶菌病威胁的背景下，阿巴拉契亚蝾螈展现出对致病性真菌Batrachochytrium dendrobatidis (Bd)的显著抗性，但其免疫防御机制尚未明确。作为全球蝾螈生物多样性热点地区，阿巴拉锡亚山区栖息着三种典型蝾螈物种：红背蝾螈(Plethodon cinereus)、双线蝾螈(Eurycea bislineata)和东方蝾螈(Notophthalmus viridescens)。这些物种对Bd感染表现出截然不同的敏感性模式，暗示其皮肤免疫系统可能存在独特防御策略。抗菌肽(AMP)作为先天免疫的关键效应分子，在调节皮肤微生物组和直接杀伤病原体方面具有双重功能，然而目前对蝾螈AMP多样性的认知仍十分有限——迄今仅发现9种蝾螈源AMP，远少于青蛙物种中发现的1000多种AMP。这种认知空白限制了我们开发基于AMP的保护策略和新型抗菌药物的潜力。

为系统解析蝾螈皮肤免疫机制，由Smithsonian保护生物学研究所领衔的国际研究团队在《npj Biofilms and Microbiomes》发表最新研究，整合多组学技术首次对三种阿巴拉契亚蝾螈的皮肤肽组与微生物组进行关联分析。研究人员采用乙酰胆碱注射和按摩两种方式收集皮肤分泌物，通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行非标记蛋白质组学分析，同时利用转录组学测序揭示皮肤基因表达谱。针对野外采集的91份皮肤分泌物样本和13份皮肤组织样本，研究团队建立定制化AMP数据库，结合五种公共AMP数据库进行同源性筛选，并采用机器学习算法预测新型AMP。为验证功能活性，研究合成20种候选肽开展针对Bd和ESKAPEE多重耐药菌 panel 的抑制实验，同时通过16S rRNA测序分析皮肤微生物组结构与肽组成的相关性。

多组学工具推动AMP发现

转录组学分析鉴定出279个属于AMP家族的氨基酸序列，聚类为150种非冗余AMP样肽。所有个体均检测到转录活跃的候选AMP基因，其中Cathelicidin肽最为丰富，在所有物种中均有发现，长度范围86-422个残基。三种蝾螈共享5种候选AMP序列，包括1种Cathelicidin、1种组蛋白H2A、1种活性氧调节剂1(Romo1)和2种泛素肽。蛋白质组学分析显示，31/91个个体(34%)检测到AMP，其中双线蝾螈占比最高。数据非依赖采集(DIA)和数据依赖采集(DDA)分别鉴定出54和38种非冗余AMP样肽，Kinin样肽最为常见但仅存在于双线蝾螈。

皮肤AMP组成与皮肤细菌组成相关联

候选AMP组成能显著预测皮肤细菌组成。在双线蝾螈中，DDA肽组成与细菌组成存在显著相关性(Jaccard-Jaccard: p=0.0019; Bray-Bray: p=0.0072)。红背蝾螈转录组衍生的肽组成与细菌组成显著相关(Jaccard-Jaccard: p=0.008)。细菌-肽相关性分析揭示多个显著关系，如假单胞菌ASV42与两种Kinin样肽呈正相关，而气单胞菌ASV59与Cathelicidin样肽呈负相关。四种推定抑Bd细菌ASV(假单胞菌ASV42/ASV551、气单胞菌ASV59、嗜麦芽窄食单胞菌ASV113)在至少两种蝾螈中与多肽存在相互作用。

粗提肽与合成肽对Bd的抑制活性有限

16/18个复合样本在一种或多种浓度下对Bd生长产生轻度抑制，最高抑制率35%出现在红背蝾螈POSH样本(75μg/mL)。三种不同物种来源的样本在所有测试浓度下均显示轻度抑制。20种合成肽中仅两种显示轻度Bd抑制，其中PrAd-Eb12在31.25μg/mL浓度下平均抑制率1-9.5%，未达到显著抗菌标准。

合成肽对人类病原体表现出活性

两种基于红背蝾螈转录组序列合成的Cathelicidin肽(Tr-Pc3/Pcin-CATH3和Tr-Pc5/Pcin-CATH5)对多重耐药菌显示显著抑制活性。Pcin-CATH3对鲍曼不动杆菌(3株)、铜绿假单胞菌(1株)和大肠杆菌(1株)具有中度抑制，最小抑菌浓度(MIC)为16-64μg/mL。Pcin-CATH5对鲍曼不动杆菌菌株5075的MIC(4μg/mL)与人类Cathelicidin LL-37和左氧氟沙星相当，同时对铜绿假单胞菌和大肠杆菌也显示抑制活性。细胞毒性实验表明，这三种肽在浓度高达5.25μg/mL时对HepG2细胞无毒性作用。

研究首次在多种脊椎动物中系统揭示AMP多样性及其与皮肤微生物组的相互作用关系。三种阿巴拉契亚蝾螈皮肤中存在高度多样的AMP repertoire，其中两种新型Cathelicidin(Pcin-CATH3和Pcin-CATH5)的发现使已知蝾螈AMP数量增至11种。多组学方法的互补性证明：转录组学更适合红背蝾螈和东方蝾螈的AMP发现，而双线蝾螈则需结合两种组学方法。皮肤肽组成与细菌组成的显著关联提示AMP通过直接调控微生物群落结构间接影响宿主-病原体互作，这为理解两栖动物在地方性Bd流行区的持续生存提供了新机制解释。从转化医学视角，对多重耐药菌具有显著抑制活性且无细胞毒性的新型Cathelicidin，为开发新型抗菌药物提供了候选分子。该研究建立的跨物种比较研究框架，为解析微生物-免疫界面在宿主适应性与进化中的作用提供了新模式。