双载体壳聚糖水凝胶-聚乳酸微粒递送系统有效缓解金黄色葡萄球菌性骨髓炎

《npj Biofilms and Microbiomes》：Dual chitosan hydrogel and polylactic acid microparticle delivery system reduces Staphylococcal osteomyelitis and soft tissue infection

本刊推荐：为应对传统全身抗生素治疗骨髓炎(OM)易产生毒性及耐药性的问题，研究人员开发了一种兼具内在抗菌活性的壳聚糖水凝胶(CH)与载磷霉素(FOS)的聚乳酸(PLA)微粒双载体递送系统。该研究通过体外抑菌实验和大鼠植入物相关性慢性骨髓炎模型证实，CH+PLA-FOS能显著降低浮游态和生物膜态金黄色葡萄球菌(S. aureus)负荷，并减少骨缺损面积和血浆触珠蛋白水平。该局部递送策略为替代系统性抗生素治疗提供了新思路。

　　

骨髓炎，这一骨骼深处的感染性疾病，历来是临床治疗的难题。尤其当致病元凶是擅长形成生物膜的金黄色葡萄球菌时，传统依靠长期、大剂量静脉或口服抗生素的“狂轰滥炸”式疗法不仅可能“误伤”患者的肝肾功能，更在无形中加速了抗生素耐药性的蔓延。更棘手的是，生物膜为细菌提供了天然屏障，而致密的皮质骨结构也阻碍了药物的渗透，使得常规治疗往往事倍功半。局部递送策略被视为破局的关键——将抗生素精准投送至感染灶，既能实现局部高浓度，提升杀菌效果，又能降低全身暴露，减少毒副作用。然而，目前作为局部递送“金标准”的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥虽能提供机械支撑，但其不可降解的特性意味着患者可能需二次手术取出，且其抗生素释放不完全，容易导致长时间亚抑制浓度给药，反而为耐药菌的滋生提供了温床。统计显示，PMMA用于感染管理的使用率已从2006年的90%降至2017年的不到40%，寻找更优替代方案的呼声日益高涨。

在此背景下，研究人员将目光投向了天然抗菌材料壳聚糖(CH)和生物可降解聚酯聚乳酸(PLA)。壳聚糖源自甲壳素，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等均显示出抗菌潜力，其与β-甘油磷酸酯(β-GP)结合可形成温敏性水凝胶。PLA则是一种经美国FDA批准的生物可降解材料，其酯键可通过简单水解降解。磷霉素(FOS)是一种广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效，其独特的作用机制——被细胞代谢并干扰细胞壁肽聚糖合成的第一步——使其与甲氧西林或万古霉素等常用抗生素不易产生交叉耐药性，且在组织中的穿透性优于万古霉素，这对治疗骨小管内的感染尤为有利。

本研究旨在构建一种基于壳聚糖水凝胶和载磷霉素PLA微粒的双载体递送系统，并评估其在治疗金黄色葡萄球菌引起的慢性骨髓炎中的效果。研究人员假设，将磷霉素同时负载于水凝胶和微粒中(CH-FOS+PLA-FOS)能最大程度地降低细菌负荷。

为开展研究，团队运用了几项关键技术：首先，采用脉冲-静止法制备载磷霉素的PLA微粒，并通过图像分析进行粒径表征；其次，利用扫描电镜-能谱分析(SEM-EDS)检测磷霉素在微粒内外的分布均匀性，并通过改良的Kirby-Bauer药敏试验验证微粒制备过程后磷霉素的生物活性保持情况；接着，通过体外浮游菌和生物膜抗菌实验评估不同载药组合（单纯CH、CH-FOS、CH+PLA-FOS、CH-FOS+PLA-FOS以及PBS-FOS对照）的抗菌效果；最后，在一个临床相关性高的大鼠股骨植入物相关性慢性骨髓炎模型中进行在体验证，通过X射线影像学长期监测骨缺损面积变化，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆触珠蛋白水平以评估全身炎症反应，并在实验终点通过菌落形成单位(CFU)计数量化骨组织和周围软组织的细菌负荷。

结果

微粒面积表征

采用5秒脉冲-静止法制备的PLA-FOS微粒，其平均面积为6529 ± 6025 μm2。粒径分布直方图显示了按面积百分比和数量百分比统计的微粒分布情况。

磷霉素微粒的组成和生物活性

EDS分析显示，指示磷霉素的元素磷在微粒表面和内部的信号分布均匀，表明磷霉素分布均一。

抗菌活性试验证实，从微粒表面洗脱的磷霉素（表面FOS）和从微粒内部释放的磷霉素（内部FOS）均保持了生物活性，其抑菌圈(ZOI)之和与同等剂量的游离磷霉素对照相当，且微粒制备过程未破坏磷霉素活性。表面FOS的抑菌圈约为内部FOS的三倍。

改良Kirby-Bauer抗菌效果

所有含磷霉素的处理组在24小时后均产生了显著不同的抑菌圈。

单纯CH组抑菌圈最小，PBS-FOS组（游离磷霉素）抑菌圈最大。CH+PLA-FOS组（磷霉素仅载于微粒中）的抑菌圈小于CH-FOS组（磷霉素仅载于水凝胶中），提示从PLA微粒中释放磷霉素更为缓慢。CH-FOS+PLA-FOS组（磷霉素平分载于两者）抑菌圈介于两者之间。

浮游菌抗菌效果

处理浮游态金黄色葡萄球菌24小时和48小时后，所有同时含有CH和FOS的组别（CH-FOS、CH+PLA-FOS、CH-FOS+PLA-FOS）在48小时时均显示出细菌减少，且其抗菌效果优于CH组和PBS-FOS组。

CH和FOS的抗菌作用在48小时显示出叠加效应。PBS阴性对照组的菌落数在所有时间点均高于其他各组。

生物膜抗菌效果

对抗生物膜的处理结果显示，在24小时和48小时，所有同时含有CH和FOS的组别均观察到CFU减少。

CH、CH+PLA-FOS和CH-FOS+PLA-FOS组的抗菌效果从24小时到48小时有所下降。在48小时时间点，单纯CH组比PBS阴性对照组显示出更强的抗菌性。CH和FOS的叠加抗菌效应在生物膜 assay 中在24小时即已显现，这可能部分归因于壳聚糖乳化作用破坏生物膜基质。

影像学分析

通过X射线影像纵向监测至第35天，骨缺损面积随时间推移而增加。

含FOS的三个处理组（CH-FOS、CH+PLA-FOS、CH-FOS+PLA-FOS）的缺损面积在第21天达到平台期，而单纯CH组的缺损面积持续增加至第35天。在第35天，单纯CH组的缺损面积大于CH-FOS和CH-FOS+PLA-FOS组。

血浆触珠蛋白分析

触珠蛋白浓度在感染后第8天（含FOS组）或第10天（单纯CH组）达到峰值，之后所有组别开始下降。

将治疗后各时间点的数据合并分析后发现，所有含FOS的处理组触珠蛋白浓度均显著低于单纯CH组，表明含FOS的治疗减轻了全身炎症反应。

骨和软组织中的细菌负荷

在感染后第35天（治疗后第28天），对骨和周围软组织中的细菌进行计数。所有含CH和FOS的处理组骨中的细菌负荷均低于单纯CH组。

在周围软组织中，仅CH-FOS+PLA-FOS组的细菌负荷低于单纯CH组。

结论与讨论

本研究成功构建并评估了一种基于壳聚糖水凝胶和聚乳酸微粒的双载体局部抗生素递送系统，用于治疗金黄色葡萄球菌引起的骨髓炎。研究表明，该递送系统能有效对抗浮游态和生物膜态的金黄色葡萄球菌。在慢性骨髓炎大鼠模型中，与单纯壳聚糖水凝胶相比，含有磷霉素的处理（尤其是磷霉素同时负载于水凝胶和微粒中的CH-FOS+PLA-FOS组）能够显著减少骨缺损面积、降低血浆触珠蛋白水平（表明炎症减轻），并降低骨组织和软组织中的细菌负荷。

该双载体系统的优势可能在于其提供了潜在的双相释放模式：PLA微粒表面的磷霉素可能实现初始突释，快速抑制感染进展；而微粒内部的磷霉素随着PLA的降解（据报道长达数周）缓慢释放，从而延长抗生素在感染部位的滞留时间，弥补从先天免疫到适应性免疫的过渡期。壳聚糖本身不仅具有内在抗菌活性（如破坏细胞膜完整性、干扰群体感应），其与生物膜基质的相互作用还可能增强磷霉素的渗透和效力。此外，即使磷霉素因环氧化物开环而失活，其降解产物在结构上类似β-GP，可能通过离子键和氢键增强水凝胶结构，延缓凝胶降解，间接延长活性磷霉素的作用时间。

尽管本研究观察到的细菌负荷降低幅度（与单纯CH组相比，骨和软组织分别降低1.12和1.04 log₁₀）未达到临床公认的3 log₁₀显著差异阈值，但其在减轻骨破坏和全身炎症方面的积极效果表明该策略具有应用潜力。本研究的一个局限性是未设置单纯高浓度抗生素静脉或腹腔注射的“金标准”治疗对照组，这有助于更直接地与临床常规治疗比较。此外，未能成功量化体内外磷霉素的释放动力学也是未来需要完善的方向。

总之，这项发表在《npj Biofilms and Microbiomes》上的研究证实，负载磷霉素的壳聚糖水凝胶-PLA微粒双载体递送系统为治疗挑战性极强的骨髓炎，特别是由生物膜形成菌引起的感染，提供了一种有前景的局部治疗替代方案。这种多功能抗菌治疗系统的开发和完善，有望改善这类顽固性感染疾病的靶向治疗效果，减少对全身抗生素的依赖，从而缓解耐药性压力和药物毒性风险。