HPV16病毒附着后中和机制研究：揭示Gardasil疫苗诱导抗体长效保护的关键

《npj Vaccines》：Post-attachment neutralization of HPV16 by antibodies derived from Gardasil-vaccinated women

本研究揭示了Gardasil疫苗接种者血清及记忆B细胞来源的单克隆抗体可通过三种新颖机制（病毒衣壳表面滞留、胞表面脱落及内化后降解）实现HPV16假病毒长达18小时的附着后高效中和。该发现为HPV疫苗诱导的“灭菌免疫”提供了分子层面解释，对优化疫苗策略具有重要意义。

　　

人乳头瘤病毒（HPV）疫苗被誉为肿瘤防治领域的里程碑，其针对高危型HPV（如HPV16）引发的宫颈癌等疾病展现出近乎完美的防护效果。尤其令人惊奇的是，即使仅接种单剂疫苗，多数接种者也能建立持久的“灭菌免疫”，即终生不再受相应HPV型别感染。这种强大的保护力主要归功于疫苗诱导产生的高水平、持久存在的型别特异性中和抗体。然而，一个关键科学问题始终悬而未决：HPV感染过程异常缓慢，病毒从结合细胞表面到完成内化需要数小时之久，抗体是否能在病毒附着于细胞后仍能有效拦截感染？传统观点认为，中和抗体主要通过阻止病毒与细胞的初始结合来发挥作用。但美国国家癌症研究院（National Cancer Institute）等机构的研究团队在《npj Vaccines》发表的最新研究，彻底颠覆了这一认知，揭示了抗体在病毒“登陆”后仍能高效中和的全新机制。

为了深入探究这一问题，研究人员设计了一套精巧的实验方案。他们使用的核心实验材料包括：利用“Shell”系统制备的、包裹了绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的HPV16假病毒（PsV），能模拟病毒入侵过程但不复制；从接种四价Gardasil疫苗的女性志愿者体内分离的血清样本以及一组13株具有表征的HPV16 L1蛋白特异性人源单克隆抗体（mAb）；以及能代表基底角质形成细胞的人类永生化角质形成细胞系HaCaT细胞。技术方法上，研究团队改进了标准的体外中和实验，建立了“附着后中和”实验模型：先让PsV与HaCaT细胞在37°C下结合不同时间（1至24小时），洗去未结合的病毒后，再加入抗体或血清，继续培养至72小时，最后通过流式细胞术检测GFP阳性细胞比例来计算中和率。此外，还综合运用了免疫荧光显微技术（区分细胞表面与细胞内病毒定位）、细胞外基质（ECM）结合实验、蛋白质G免疫共沉淀（分析病毒-抗体复合物的释放）以及蛋白酶体抑制剂（Bortezomib）和液泡ATP酶抑制剂（BafA1 A1）处理等生化手段，深入阐明了不同中和机制的具体环节。

结果

标准中和实验证实强大的附着后中和能力

研究人员首先在HaCaT细胞上验证了9株具有中和活性的mAb的中和效果。与传统“附着前中和”（抗体与病毒预先孵育）相比，令人惊讶的是，当抗体在PsV与细胞结合后1、3、6小时甚至更晚加入时，所有9株mAb依然表现出强大的中和能力。

特别是在病毒附着3小时后加入抗体，即使将疫苗接种者的血清稀释250倍，仍能观察到几乎完全的中和。中和活性随时间推移逐渐下降，但直至18小时，所有mAb在最高浓度下仍能抑制至少50%的感染，24小时时活性才基本消失。计算出的半最大抑制浓度（IC₅₀）在附着后3小时内与附着前中和相比变化不大，显示了惊人的持久力。此外，唯一一株能交叉中和HPV31的mAb H16.146，对HPV31也表现出类似的附着后中和特性。

揭示三种不同的附着后中和机制

通过精密的免疫荧光实验，研究人员区分了抗体与病毒结合后，位于细胞表面/ECM和细胞内的病毒颗粒。他们发现了三种截然不同的附着后中和机制：

1. 1.
   病毒衣壳滞留细胞表面：以mAb H16.50为代表，抗体结合后，病毒被长时间“困”在细胞表面，无法有效内化。
2. 2.
   病毒衣壳从细胞表面脱落：以mAb H16.112、H16.64、H16.139为代表，抗体诱导已经结合在细胞表面的病毒脱落下来，从而终止感染。免疫共沉淀实验证实了这些mAb处理后的细胞上清液中存在病毒-抗体复合物。
3. 3.
   病毒衣壳内化后快速降解：以mAb H16.84、H16.146、H16.60为代表，病毒虽能被内化，但抗体随之进入细胞内，并引导病毒进入降解途径。使用BafA1抑制溶酶体降解后，细胞内病毒信号显著增强，证实了降解途径的存在。而蛋白酶体抑制剂Bortezomib则无此效果，排除了TRIM21介导的胞质抗体降解途径的参与。
   

值得注意的是，许多mAb和疫苗血清表现出混合的中和机制。例如，H16.146既能部分滞留病毒于细胞表面，又能促进已内化病毒的降解。

疫苗接种者血清同样具有强大的附着后中和能力

对Gardasil疫苗接种者血清的分析得到了与mAb一致的结果。无论是接种前未感染HPV的女性，还是已有自然感染史的女性，其接种后血清均表现出强大的附着前和附着后中和活性，即使在病毒附着3小时后，血清稀释250倍仍能几乎完全抑制感染。对血清中和机制的分析也显示了类似的异质性，有些血清主要诱导病毒脱落，有些则主要导致病毒滞留或降解。与自然感染产生的血清相比，疫苗接种诱导的血清反应更倾向于完全阻止病毒与细胞的初始结合（附着前中和），但在附着后阶段，其中和机制更为多样。

讨论与结论

本研究系统性地证明了HPV疫苗诱导的中和抗体具有非凡的附着后中和能力，其有效窗口期可长达病毒附着后18小时。这为HPV疫苗为何能产生近乎“灭菌免疫”的效果提供了强有力的分子解释。HPV在体内的感染过程缓慢，病毒需要首先结合于受损上皮暴露的基底膜上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG），经历数小时的构象变化后，才能转移至基底角质形成细胞并启动内化。这一漫长的“窗口期”为抗体提供了充足的时间在病毒抵达细胞表面甚至内化之后进行拦截。

研究发现的三重机制——滞留、脱落、降解——共同构成了一道坚固的防线。尤其重要的是，即使是针对单一表位的单克隆抗体，也能通过多种机制发挥作用，这揭示了抗体中和HPV的复杂性远超此前认知。病毒从结合到内化的异步性和缓慢进程，以及内化后抗体仍能进入细胞内囊腔并干预感染步骤（如次要衣壳蛋白L2的构象变化及其介导的病毒基因组向高尔基体/核的转运），是附着后中和得以实现的结构基础。

该研究不仅深化了对HPV疫苗保护机理的理解，也可能为未来疫苗研发（如广谱HPV疫苗）和抗体疗法提供新思路。证明抗体能在病毒生命周期的多个后期阶段有效干预，这一定位对其他病毒的疫苗和抗体研究也具有重要的借鉴意义。总之，这项工作揭示了HPV疫苗卓越效力的深层免疫学机制，巩固了其作为预防癌症利器的重要地位。