基于适配体与CRISPR-Cas12a联用的多菌灵快速灵敏检测新方法

《Scientific Reports》：An integrated Aptamer-CRISPR-Cas12a method for rapid and sensitive detection of carbendazim

为解决农产品和中药材中多菌灵（CBZ）农药残留检测技术流程复杂、依赖专业设备且成本高昂的问题，研究人员开发了一种新型Aptamer-CRISPR/Cas12a检测方法。该方法通过整合适配体的高特异性与CRISPR/Cas12a系统的信号放大能力，实现了CBZ的快速、高灵敏检测，线性范围为10–5000 ng/mL，检测限（LOD）低至10 ng/mL，并在真实样品中展现出92.10%–102.86%的回收率。该方法操作简便、耗时约40分钟，为现场快速检测提供了可靠工具，并具备通过更换适配体实现多目标物检测的模块化潜力。

　　

在农业生产和中药材栽培中，多菌灵（Carbendazim, CBZ）作为一种高效、广谱的苯并咪唑类杀菌剂被广泛使用。然而，由于其稳定的苯并咪唑环结构，CBZ在环境（如土壤、水体）及农产品中残留持久，过量摄入可能导致呕吐、腹泻、肝损伤及神经系统损害等健康风险。各国针对果蔬中的CBZ设定了最大残留限量（MRL），例如中国规定猕猴桃中为5.0 mg/kg，芒果中为2 mg/kg，巴西甚至全面禁用。现有检测方法包括分光光度法、液相色谱、液相色谱-质谱联用、酶免疫分析及多种传感器技术，虽各有优势，但普遍存在前处理复杂、依赖专业仪器、成本高等问题，不利于大规模现场快速筛查。因此，开发一种灵敏、快速且适用于现场应用的CBZ残留检测方法迫在眉睫。

为此，张雯静等研究人员在《Scientific Reports》上发表了一项创新研究，他们成功将适配体（Aptamer）的高特异性识别能力与CRISPR/Cas12a基因编辑工具的高灵敏度信号放大特性相结合，构建了一种名为Aptamer-CRISPR/Cas12a的检测新方法。该方法不仅操作简单、设备要求低，还能在大约40分钟内完成检测，非常适合资源有限条件下的现场应用。

研究团队在关键技术方法上主要运用了以下几项策略：首先通过分子对接（使用Discovery Studio 2019软件）预测CBZ与适配体的结合位点，指导互补链（APT-C）的设计；其次利用链霉亲和素磁珠（SA-MBs）固定生物素化适配体-互补链双链（MBs-APT-APT-C复合物），实现样品中CBZ存在时互补链的高效置换与分离；最后借助CRISPR/Cas12a系统（使用LbaCas12a酶及特定crRNA）对释放的互补链进行识别并触发反式切割活性，通过荧光标记的ssDNA报告分子（FAM-TTATT-BHQ1）产生可定量的荧光信号，从而实现CBZ的灵敏、定量检测。实验中所用的真实样本（猕猴桃、芒果、黄瓜）购自本地超市，并通过加标回收实验验证方法的实际适用性。

互补链的设计与优化

通过分子对接分析，研究人员确定了CBZ在适配体上的关键结合位点（G2、A3和T51）。基于此，他们设计了两条互补链：APT-C1（覆盖结合位点）和APT-C2（避开结合位点）。荧光检测结果表明，在CBZ存在下，APT-C1的置换效率显著高于APT-C2，且其对应的CRISPR/Cas12a反应产生的荧光信号更强、动力学响应更优，因此选择APT-C1用于后续实验。

置换反应时间的优化

为确定最佳置换反应时间，研究比较了10、15、20和30分钟四个时间点下的荧光信号。结果显示，20分钟和30分钟反应所得产物的荧光值显著高于10和15分钟组，且20分钟与30分钟之间无显著差异。因此，选择20分钟作为最优置换反应时间，以实现高效率和良好的信号激活效果。

Aptamer-CRISPR/Cas12a检测法的灵敏度

采用系列浓度CBZ（0–5000 ng/mL）进行检测，结果显示荧光强度随CBZ浓度增加而升高，在10–5000 ng/mL范围内呈现良好线性关系（15分钟时R2=0.9639，30分钟时R2=0.9774），方法检测限（LOD）为10 ng/mL。低浓度样本在CRISPR/Cas12a反应20分钟后信号即趋于稳定，因此后续实验将反应时间定为20分钟。

Aptamer-CRISPR/Cas12a检测法的特异性

在特异性评估中，CBZ（100 ng/mL）能引发显著荧光增强，而其他非靶标农药（如噻菌灵、甲基硫菌灵、氧乐果、吡虫啉、啶虫脒，浓度均为1000 ng/mL）所产生的信号与阴性对照无显著差异，表明方法对CBZ具有高度特异性，无交叉反应。

Aptamer-CRISPR/Cas12a检测法的实际应用

在猕猴桃、芒果和黄瓜等真实样品中进行的加标回收实验显示，CBZ的回收率在92.10%–102.86%之间，相对标准偏差（RSD）为3.30%–4.83%，表明方法在复杂基质中仍具备良好的准确度和可靠性。

本研究成功构建了一种整合适配体与CRISPR/Cas12a系统的检测新平台，实现了对多菌灵（CBZ）的快速、高灵敏、高特异性检测。该方法在40分钟内即可完成检测，线性范围宽（10–5000 ng/mL）、检测限低（10 ng/mL），并在实际样品中表现出优异的准确度与精密度。其模块化设计使得crRNA序列可作为通用组件，未来仅通过更换适配体与互补链即可扩展至其他小分子污染物的检测，极大提升了方法的通用性与应用前景。尽管目前主要基于加标样本进行验证，在真实复杂样本中的性能仍需进一步考察，但该研究无疑为农产品安全、中药质量控制及环境监测领域提供了一种强有力的现场快速筛查工具。