代谢工程改造朝鲜蓟愈伤组织作为高价值脂肪酸衍生物生产平台的综合评估

《Scientific Reports》：A comprehensive evaluation of metabolically engineered Cynara cardunculus calli as platform for valuable fatty acid derivatives production

本研究针对全球能源需求增长与气候变化问题，通过代谢工程手段对朝鲜蓟（Cynara cardunculus）愈伤组织进行遗传改造，成功构建了高产油酸的高油酸细胞平台。研究人员通过SAD过表达和FAD2.2基因沉默技术，结合转录组学、qRT-PCR和共聚焦显微镜分析，发现工程化细胞系在液态培养中油脂积累显著提高（SAD-OE达19.24%），且油体数量增加5倍。该研究为可持续生物燃料前体生产提供了新策略，避免了全株植物代谢工程常见的生长障碍问题。

　　

随着全球能源需求的持续增长和气候变化的日益严峻，寻找可持续的可再生能源已成为当务之急。传统化石燃料的大量使用导致碳排放激增，迫切需要转向绿色、可再生的能源解决方案。在这种背景下，植物油作为一种潜在的生物燃料前体备受关注。然而，通过基因工程改造油料作物提高油脂产量常常面临一个棘手难题：油脂的积累往往以牺牲植物正常生长为代价，导致光合作用受损、生长发育不良。更令人担忧的是，油料作物的大规模种植会占用宝贵的耕地资源，可能影响粮食供应，并带来温室气体排放增加、水污染等环境问题。

难道就没有两全其美的解决方案吗？科学家们将目光投向了植物细胞培养技术。与整株植物相比，植物细胞培养具有不受季节气候影响、不占用耕地、代谢产物易于调控等优势。在众多候选植物中，朝鲜蓟（Cynara cardunculus）因其高生物量和富含油脂的特性而脱颖而出。前期研究表明，通过代谢工程手段改造朝鲜蓟愈伤组织，使其过表达硬脂酰-ACP去饱和酶（SAD-OE）或通过RNA干扰沉默脂肪酸去饱和酶（FAD-KD），能够显著改变脂肪酸组成，提高油酸含量。但这些遗传改造是否会引起有害的转录组扰动？工程化细胞在规模化培养中能否保持稳定的油脂生产能力？这些问题仍有待深入探究。

发表在《Scientific Reports》的这项研究对代谢工程改造的朝鲜蓟愈伤组织进行了全面评估，旨在将其开发为高价值脂肪酸衍生物生产的平台。研究人员通过转录组分析、时间进程基因表达监测、规模化培养评估以及细胞学观察等多种手段，系统探究了工程化细胞系的转录特征、油脂积累动态和工业化应用潜力。

为开展本研究，研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：使用Illumina NovaSeq 6000进行RNA测序（RNA-seq）分析转基因细胞系的转录组变化；通过实时定量PCR（qRT-PCR）验证RNA-seq结果并监测油脂合成关键基因的动态表达；建立规模化液体培养系统（50mL至250mL）评估生物量生产力；采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量评估氧化应激；通过尼罗红和DAPI染色结合共聚焦显微镜观察油体 accumulation。实验材料为先前建立的野生型（WT）、SAD过表达（SAD-OE）和FAD沉默（FAD-KD）朝鲜蓟愈伤组织细胞系。

转录组分析

为探究遗传改造对细胞转录组的全局影响，研究人员对SAD-OE、FAD-KD和野生型（WT）愈伤组织进行了RNA-seq分析。结果显示，与WT相比，SAD-OE中有3，694个差异表达基因（DEGs）（1，553个上调，2，141个下调），而FAD-KD中高达6，913个DEGs（4，207个上调，2，706个下调），表明FAD基因沉默引起了更广泛的转录重编程。

KEGG通路富集分析显示，两个转基因系中与脂肪酸代谢及其相关通路（如糖酵解、丙酮酸代谢、甘油酯代谢和甘油磷脂代谢）相关的DEGs均显著富集。在SAD-OE系中，上调DEGs主要富集在DNA修复、蛋白质去磷酸化等过程，而下调DEGs则与跨膜运输、防御反应等相关。FAD-KD系中，上调DEGs与脂质代谢过程、氧化应激响应等密切相关，而下调DEGs主要涉及蛋白质磷酸化和泛素化等过程。

碳和脂肪酸通路分析

研究人员特别关注了碳代谢和脂肪酸合成相关通路的DEGs。在碳同化方面，SAD-OE和FAD-KD分别鉴定出68和89个DEGs。在脂肪酸代谢方面，两个转基因系中大多数DEGs呈现上调趋势，尤其是在脂肪酸生物合成、甘油酯代谢和甘油磷脂代谢通路中，上调比例达70-80%。

对三酰甘油（TAG）合成关键途径（肯尼迪途径）的深入分析发现，在SAD-OE系中，内质网中的多数酶（如FAD、GPAT和PAP）表达下调，而一个二酰甘油酰基转移酶（DGAT）和FATA则上调。在FAD-KD系中，TAG生物合成最后几步的相关基因普遍上调，包括脂肪酸去饱和酶（FADs）、甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPATs）、溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAAT）和三个DGAT。此外，两个磷脂酶（PLA1和PLA2）也上调，这些酶水解磷脂为TAG合成提供前体。

转录因子差异表达

油脂生物合成受到转录水平的精细调控。研究人员鉴定了257个（SAD-OE）和364个（FAD-KD）差异表达转录因子（DETFs）。ERF、bHLH、MYB、WRKY、C2H2、bZIP、LBD、NAC、C3H和GRAS家族成员在两个转基因系中均为最丰富的DETFs。值得注意的是，在SAD-OE中大多数DETFs下调，而FAD-KD中多数上调，尤其是ERF、MYB和WRKY家族成员。与油脂生物合成调控相关的AP2和B3家族转录因子在两个系中均有出现。

朝鲜蓟液体培养中TAG生物合成的时间基因表达模式

为探究TAG形成的转录动态，研究人员在10天的液体培养时间进程中监测了关键调控和生物合成基因的表达。结果显示，在SAD-OE和FAD-KD系中，大多数分析基因（包括转录因子ABI4、FUS3、WRI1，以及DGAT1、DGAT2和Oleosin）在第3天出现上调趋势，随后至第10天急剧下降。在SAD-OE系中，这些基因的表达峰值出现在第3天，而在FAD-KD系中则延迟至第5天。这表明两个转基因系虽然具有不同的转录激活时序，但均表现出这些调控因子的协同表达。

规模化培养下朝鲜蓟细胞培养物的生物量生产力和代谢产出

将液体培养规模从50mL放大至250mL后，转基因细胞系表现出优于野生型的生长特性。培养10天后，SAD-OE和FAD-KD悬浮细胞的生物量生产力均达到约2 g DW L^-1 d^-1，显著高于野生型。转基因系还表现出更高的细胞内水分含量，表明遗传改造对细胞渗透调节产生了影响。

脂质过氧化评估显示，在第5天，转基因系（尤其是SAD-OE）的MDA含量显著高于野生型，表明早期遭遇氧化应激；但到第10天，转基因系的MDA水平下降，而野生型反而上升，提示转基因细胞可能通过适应性反应克服了氧化胁迫。

油脂含量和果聚糖积累分析表明，在规模化液体培养中，所有细胞系均随培养时间推移而积累油脂，但转基因系显著优于野生型。SAD-OE系的油脂含量从第1天的11.01%增加至第10天的19.24%，FAD-KD系从9.18%升至14.64%，而野生型仅从5.96%升至8.81%。果聚糖积累动态与油脂积累呈负相关：在野生型中，果聚糖含量随培养时间增加而上升，而在两个转基因系中则下降，表明果聚糖可能作为TAG生物合成的碳源被消耗。

油体检测和TAG积累

通过尼罗红（染色中性脂质）和DAPI（染色细胞核）双染色结合共聚焦显微镜分析，在培养结束时（第10天）评估了细胞中油体的积累情况。结果显示，野生型细胞中检测到的油体约占细胞核总数的25%，而SAD-OE系提高了5倍，FAD-KD系提高了4倍。此外，转基因系中油体的平均面积也显著大于野生型（野生型、SAD-OE和FAD-KD的平均面积分别为10.5、31.4和26 μm²），表明遗传改造不仅增加了油体数量，也增大了其尺寸。

本研究对代谢工程改造的朝鲜蓟愈伤组织进行了全面系统的评估，证实其作为高价值脂肪酸衍生物生产平台的巨大潜力。通过转录组学、分子生物学和细胞生物学等多层次分析，揭示了SAD过表达和FAD沉默对细胞转录组、代谢通路和油脂积累的深远影响。研究结果表明，工程化细胞系在规模化液体培养中不仅能保持正常的生长状态，还能高效积累油脂，尤其是SAD-OE系表现出最优的油脂生产能力。

该研究的创新之处在于首次将代谢工程策略应用于植物细胞培养系统用于改变脂肪酸组成和提高油脂含量，并提供了详细的分子机制解析。与传统整株植物代谢工程相比，该细胞平台避免了生^长发育受损和光合作用受抑制等问题，为可持续生物燃料前体和高端油脂化学品的生产提供了新思路。研究还发现果聚糖可能作为TAG生物合成的碳源，这为优化培养策略、进一步提高油脂产量指明了方向。

工程化朝鲜蓟细胞液体培养平台展现出多重优势：快速生长利于油脂含量优化，支持油体规模化生产；定制化油脂生产可用于生物塑料等基础化学品的规模化制造；天然油体的积累为靶向蛋白生产或分子固定提供了新型亚细胞工厂。该方法可推广至其他油料或多用途物种，为油体和富集油体生产开辟了新途径，符合循环经济原则，在生物化妆品、绿色化学和益生元等高附加值领域具有广阔应用前景。