靶向TRF1:TIN2蛋白相互作用的首创类小分子抑制剂的发现及其在破坏端粒保护复合物组装中的意义

《Scientific Reports》：Discovery of first-in-class inhibitors of the TRF1:TIN2 protein:protein interaction by fragment screening

本研究针对癌症治疗新靶点——端粒保护复合物shelterin的关键亚基TRF1，通过片段筛选首次发现了能有效抑制TRF1与TIN2蛋白相互作用的小分子化合物。研究人员利用X射线晶体学(XChem)和配体观测核磁共振(LO-NMR)技术，鉴定出结合于TRF1TRFH结构域TIN2结合位点的片段 hits，并优化获得先导化合物40 (IC50=67μM)，该化合物能特异性将TRF1从完整shelterin复合物中解离。这项工作为开发靶向shelterin组装的新型抗癌药物提供了重要基础。

　　

在细胞染色体的末端，有一段特殊的DNA-蛋白质结构称为端粒，它如同鞋带两端的塑料帽，保护染色体末端不被误认为是DNA损伤而触发细胞死亡程序。这个"安全帽"的核心是由六个蛋白质组成的端粒保护复合物shelterin，其中TRF1（端粒重复结合因子1）扮演着至关重要的角色。它不仅帮助复合物正确组装在端粒上，还参与调控端粒长度的维持。近年来科学家发现，通过遗传学手段或化学方法抑制TRF1的功能，能够有效抑制小鼠中肺癌、胶质母细胞瘤和肾细胞癌的生长，而不会影响小鼠的生存或正常组织功能，这使得TRF1成为一个极具潜力的抗癌治疗靶点。

然而，迄今为止，科学界还没有发现能够直接抑制TRF1与其搭档TIN2（TRF1相互作用核因子2）相互作用的小分子化合物。TRF1通过其TRF同源结构域(TRF1_TRFH)与TIN2蛋白上的一个短线性基序（称为TRFH结合基序，TIN2_TBM）相结合，这一相互作用对TRF1正确招募到shelterin复合物中至关重要。开发能够破坏这一相互作用的小分子工具，不仅有助于深入理解端粒维持机制，还可能为开发新型抗癌疗法奠定基础。

为了解决这一科学问题，由Giacomo Casale、Manjuan Liu等研究人员组成的团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们采用基于片段的药物发现(FBDD)策略，综合运用X射线晶体学片段筛选、配体观测核磁共振(LO-NMR)技术，成功发现了一系列结合在TRF1_TRFH结构域TIN2结合位点的片段 hits，并进一步优化获得了首个能够抑制TRF1:TIN2相互作用的小分子化合物。

关键技术方法

研究人员主要运用了以下关键技术：1) X射线晶体学(XChem)片段筛选，使用PanDDA算法分析碎片结合；2) 配体观测核磁共振(LO-NMR)片段筛选，包括CPMG和R2KD结合亲和力测定；3) 荧光偏振(FP)竞争实验评估化合物活性；4) 质量光度法(MP)分析shelterin复合物解离；5) 蛋白质晶体学结构解析，包括开发新的P4₁2₁2晶体系统；6) 计算机辅助片段对接优化。所有蛋白质均在E. coli或Sf9昆虫细胞中重组表达纯化。

结果

原发性片段筛选及结构分析

研究人员首先通过X射线晶体学对TRF1_TRFH进行片段筛选，从983个片段中鉴定出19个高置信度的片段 hits，这些片段主要结合在TIN2_TBM的结合口袋中。结构分析显示，这些片段与TRF1_TRFH的四个关键残基（R102、E106、Q127和R131）发生相互作用，这些残基同样参与TIN2肽段的结合。

正交验证与新型晶体系统开发

由于初始晶体系统中存在晶体堆积问题，研究人员开发了新的P4₁2₁2晶体系统，该系统的TIN2结合位点更加暴露，为片段结合提供了更自然的环境。同时，通过LO-NMR CPMG筛选，研究人员鉴定出一个具有磺酸基的萘类片段27，其解离常数(K_D)为280μM。

结构导向优化与活性验证

基于片段27的结构，研究人员合成了一系列类似物，并利用新的晶体系统解析了它们的结合模式。通过结构导向的优化，他们获得了化合物40，该化合物在FP实验中的IC₅₀为67μM，在R2KD实验中的K_D为29μM。

化合物40从shelterin复合物中驱逐TRF1

最关键的是，研究人员通过质量光度法和Western blot实验证明，化合物40能够剂量依赖性地将TRF1从完整的shelterin复合物中解离出来，而对TRF2和TIN2没有影响，这表明化合物40能够特异性破坏TRF1与shelterin复合物的结合。

第二次晶体学片段筛选

利用新的晶体系统，研究人员进行了第二次XChem筛选，获得了更多样化的片段 hits，这些片段分布在TIN2结合位点的不同区域，为后续的片段连接和合并提供了丰富的起点。

结论与讨论

这项研究标志着在靶向TRF1:TIN2蛋白-蛋白相互作用领域取得了重要突破。研究人员不仅发现了一系列结合在TRF1_TRFH结构域TIN2结合位点的片段 hits，还通过结构导向的优化获得了具有中等微摩尔级活性的先导化合物40，并证明该化合物能够特异性将TRF1从完整的shelterin复合物中解离出来。

尽管目前获得的化合物在活性和细胞通透性方面仍有改进空间，但这项研究为开发高效、细胞通透性的TRF1:TIN2相互作用抑制剂奠定了坚实基础。特别是新开发的P4₁2₁2晶体系统以及从中获得的多样化片段 hits，为后续通过片段连接、合并等策略设计更高效抑制剂提供了宝贵资源。

这类小分子工具化合物的进一步发展，将极大地促进对shelterin复合物组装层次结构、端粒维持机制以及相关癌症治疗策略的理解。正如Nuthin-3、ABT-263/Navitoclax和JQ1等成功的PPI抑制剂所示，开发纳摩尔级高效的TRF1:TIN2相互作用抑制剂在原则上是可行的，这将为靶向端粒通路的新型抗癌疗法开辟新的道路。