基于PLGA-生物活性玻璃支架递送PHD2 siRNA协同促进血管生成与成骨分化的优化策略

《Scientific Reports》：Optimized delivery of RNA silencing prolyl hydroxylase domain 2 for enhanced angiogenesis and osteogenesis using bioactive glass scaffolds

本研究针对骨再生中血管化不足的难题，开发了负载PEI/PHD2 siRNA复合物的PLGA-生物活性玻璃支架。通过沉默缺氧诱导因子HIF-1α的关键负调控因子PHD2，显著增强人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的血管生成能力和人乳牙干细胞（SHED）的成骨分化。该双功能支架为颅颌面骨再生提供了新型基因激活材料平台。

　　

在口腔颌面外科领域，大段骨缺损的修复始终是临床医生面临的重大挑战。无论是外伤、肿瘤切除还是先天性畸形导致的骨组织缺失，其成功再生的核心在于新生骨组织必须具备良好的血管化网络。传统骨移植材料如自体骨、异体骨等存在供区损伤、免疫排斥和吸收不可控等局限，尤其难以在复杂缺损中建立有效的血供系统。近年来研究发现，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）作为细胞氧感知的核心调控因子，在协调血管生成与成骨分化过程中发挥关键作用。然而在常氧条件下，脯氨酰羟化酶结构域蛋白2（PHD2）会介导HIF-1α的降解，限制了其生物学功能的发挥。

针对这一科学问题，泰国玛希隆大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项创新性研究，他们设计了一种基因激活型组织工程支架——将聚乙烯亚胺（PEI）复合的PHD2小干扰RNA（siRNA）负载于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）-生物活性玻璃复合材料中，构建出具有双重功能的新型骨修复材料。该研究通过精巧的实验设计证实，这种支架不仅能实现siRNA的控释传递，还可通过调控HIF-1α信号通路同步促进血管生成和成骨分化，为解决骨再生中血管化难题提供了新思路。

研究人员主要采用以下关键技术方法：通过透射电镜和纳米颗粒追踪分析表征PEI/siRNA复合物的理化性质；利用基质胶试管形成实验评估血管生成能力；采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人乳牙脱落干细胞（SHED）建立单培养/共培养模型；通过碱性磷酸酶活性检测、免疫荧光染色和实时定量PCR等技术系统评价支架的生物学效应。

物理表征和复合物形成

研究首先优化了基因递送系统，制备了不同氮磷比（N:P）的PEI/PHD2 siRNA复合物。透射电镜显示复合物呈均匀球形，随着PEI比例增加（3:1→8:1），粒径从131.4 nm减小至90.9 nm。凝胶阻滞实验证实当N:P比≥3:1时，siRNA迁移完全被抑制，表明PEI能有效包裹siRNA。

siRNA复合物的生物学效应

细胞毒性实验显示各比例复合物对HUVEC的存活率均>90%，证明其良好生物相容性。试管形成实验中，8:1组表现出最显著的促血管生成能力，在12小时形成密集的管网结构，环状结构数量显著高于其他组别（p<0.05）。

siRNA释放特性

通过收集支架条件培养基进行间接评估发现，siPBG10组（负载复合物的支架）在1、6、24小时收集的培养基均能显著促进HUVEC的试管形成。特别是在24小时时间点，siPBG10组诱导形成的血管样网络更完整、连续，表明支架能持续释放具有生物活性的siRNA复合物。

支架生物相容性

活死染色显示HUVEC和SHED在两种支架上均保持良好的存活状态。细胞在第1天主要附着于支架表面，第4天开始向内部迁移，第7天呈现出良好的伸展形态。增殖实验进一步证实，siPBG10组在培养早期（1-7天）能显著促进HUVEC增殖。

血管生成特性

CD31免疫荧光显示，在HUVEC单培养中，siPBG10组在所有时间点均检测到CD31表达，且强度高于PBG10组。基因表达分析发现，GATA2在siPBG10单培养组中表达最高（12小时达峰），而ZEB2在共培养组中表达更显著，表明PHD2沉默能差异化调控血管生成相关基因。

成骨分化特性

碱性磷酸酶（ALP）染色和活性检测显示，siPBG10共培养组在整个培养期间保持最强的ALP活性和染色强度。成骨相关基因表达分析表明，SP7、RUNX2等早期标志物在7-14天表达最高，而COL1A1、OCN等晚期标志物在21-28天显著上调，特别是共培养组在21天时OCN表达达到峰值，表明成骨分化进程更加完善。

这项研究的创新性在于首次将PHD2基因沉默策略与PLGA-生物活性玻璃支架相结合，通过调控内源性HIF-1α通路实现血管生成与成骨分化的协同促进。相较于传统生长因子递送系统，这种基因激活支架具有作用持久、靶向性强的优势。特别值得注意的是，HUVEC与SHED以1:1比例共培养时产生的协同效应最为显著，说明内皮细胞与干细胞的相互作用对骨再生至关重要。

研究团队在讨论中指出，PHD2抑制通过稳定HIF-1α，不仅能上调VEGF等血管生成因子，还能通过Wnt/β-连环蛋白和BMP信号通路的交叉对话促进成骨分化。这种双重调控机制为理解血管化骨再生提供了新的分子视角。尽管该研究目前仅限于体外实验，但其构建的多功能支架平台为后续大型动物实验和临床转化奠定了坚实基础，在牙槽嵴增宽、颌骨重建等口腔临床领域具有广阔应用前景。