细胞外线粒体DNA通过激活补体系统参与院外心脏骤停患者的无菌性炎症反应

《Scientific Reports》：Extracellular mitochondrial DNA activates complement and is associated with complement activation in patients with out-of-hospital cardiac arrest

本研究针对院外心脏骤停(OHCA)后无菌性炎症反应的关键机制展开探索。研究人员发现内源性线粒体DNA(mtDNA)能够直接激活补体系统，在人体全血和血浆中引起C3bc、C3bBbP和sC5b-9的剂量和时间依赖性升高，而核DNA(nDNA)无此效应。临床数据分析显示OHCA患者血浆mtDNA水平与补体激活标志物显著相关，揭示了mtDNA-补体轴在心脏骤停后炎症反应中的重要作用，为开发新型抗炎疗法提供了理论依据。

　　

当心脏突然停止跳动，院外心脏骤停(OHCA)患者不仅面临即时生命威胁，还要承受后续的全身性炎症反应带来的二次打击。这种无菌性炎症反应与缺血再灌注损伤(IRI)密切相关，常常导致多器官功能衰竭和死亡。尽管科学家们已经认识到这一问题的重要性，但引发这种过度炎症反应的全部分子机制仍不明确。

近年来，细胞外线粒体DNA(mtDNA)作为损伤相关分子模式(DAMP)引起了广泛关注。mtDNA具有细菌起源，含有免疫刺激性的低甲基化CpG基序，能够通过Toll样受体(TLR)-9等模式识别受体(PRR)激活免疫系统。更引人注目的是，研究发现mtDNA的合成类似物能够激活补体系统——这是先天免疫的重要组成部分，通过C3b调理作用和C5b-9介导的细胞裂解来清除病原体和细胞碎片。

然而，内源性mtDNA是否真的能够激活补体系统，以及在心脏骤停等临床情况下这种激活是否具有实际意义，仍然是一个未解之谜。为了解决这一问题，来自奥斯陆大学医院的研究团队开展了一项创新性研究，成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员采用了几项关键技术方法：从人胎盘组织中平行分离mtDNA和nDNA并通过酚-氯仿-异戊醇(PCI)法提取；使用定量实时聚合酶链反应(qPCR)精确测定DNA拷贝数；建立水蛭素抗凝的人全血和血浆模型进行体外补体激活实验；通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测补体激活产物(C3bc、C3bBbP、sC5b-9)；并分析了55名OHCA患者入院时的血浆样本，探讨DNA水平与补体激活的临床关联。

生产及核DNA与线粒体DNA的相对得率

研究人员从人胎盘组织中纯化mtDNA和nDNA，通过差异离心和PCI提取实现了mtDNA的选择性富集。线粒体组分中nDNA:mtDNA比值为1.38，而核组分中该比值达到512，表明成功获得了高纯度的mtDNA富集组分。

mtDNA而非nDNA在全血和血浆中激活补体

将mtDNA富集组分与人体全血或血浆共同孵育后，补体激活产物(C3bc、C3bBbP和sC5b-9)呈现剂量和时间依赖性增加。最高浓度(9000拷贝/μl)的mtDNA引起血浆中C3bc和sC5b-9显著升高，而nDNA孵育组与阴性对照组无差异，证明补体激活由mtDNA特异性驱动。

OHCA患者血浆mtDNA和nDNA与补体水平、临床参数及损伤生物标志物的关联

OHCA患者样本显示平均mtDNA浓度为307拷贝/μl。血浆mtDNA和nDNA水平相互间显著强相关，且与C3bc程度呈中等相关，与sC5b-9呈强相关。mtDNA浓度与SOFA评分和自主循环恢复时间(Time-to-ROSC)呈弱正相关。在细胞标志物中，仅sCD14(TLR共受体)与nDNA水平弱相关。

本研究首次证实内源性mtDNA可在人体血浆和全血模型中以剂量和时间依赖性方式激活补体系统。更重要的是，在OHCA患者中观察到mtDNA水平与补体激活程度之间存在强劲关联，为理解无菌炎症过程中的免疫系统激活机制提供了重要证据。虽然nDNA在体外实验中不激活补体，但在患者体内与补体水平相关，这可能反映了细胞损伤时mtDNA和nDNA的同时释放。

这一发现具有重要的临床意义。认识到补体系统和TLR-9都是细胞外mtDNA的上游传感器，针对C5和CD14的联合抑制可能成为减轻无菌炎症的新治疗策略。然而，这一概念仍需进一步研究验证。该研究的优势在于使用了生理相关浓度的mtDNA，并采用了水蛭素抗凝的全血模型这一生理相关性极强的实验系统。局限在于样本量有限，未能进行通路特异性抑制实验，且mtDNA含量与临床结局变量无显著统计学关联，需要在更大队列中进一步验证。

总之，这项研究揭示了mtDNA激活补体系统的新机制，为心脏骤停等危重疾病中的炎症反应提供了新的解释，也为开发针对无菌性炎症过程的创新治疗方法指明了方向。