细菌细胞多参数定量分析：数字全息显微术的高通量干质量与形态表征

《Scientific Reports》：Multiparametric quantification of bacterial cells using digital holographic microscopy

本研究针对细菌快速鉴定与生理状态评估的迫切需求，开发了一种基于数字全息显微术（DHM）的高通量单细胞分析流程。通过结合多项式背景校正、高斯滤波与自适应掩模技术，研究人员实现了对表皮葡萄球菌（S. epidermidis）和大肠杆菌（E. coli）的干质量（dry mass）及形态参数（如圆形度、偏心度）的同步测量。该方法在液体环境中无需标记即可区分单/簇状球菌与杆菌伸长模式，且与纳米机械质谱（NMS）的干质量分布结果高度一致。该技术为抗生素敏感性测试、细菌生长动力学监测提供了新工具，推动了精密微生物学的发展。

　　

在全球公共卫生领域，细菌感染及其引发的败血症每年导致约4900万病例和1100万死亡，而抗生素滥用加剧了超级耐药菌的蔓延。世界卫生组织已将抗菌耐药性列为人类面临的十大公共卫生挑战之一。传统微生物鉴定技术如电子显微镜虽能提供高分辨率形态信息，但需真空环境且无法定量干质量；光学显微镜对比度低且缺乏定量能力；悬浮微通道谐振器（SMR）和纳米机械质谱（NMS）虽能实现飞克级质量测量，却受限于真空条件、复杂仪器或低通量。这些瓶颈催生了对无需标记、非侵入、可实时分析细菌生理状态新技术的迫切需求。

在此背景下，定量相位成像（QPI）技术应运而生，其中数字全息显微术（DHM）通过分析光波通过透明样品产生的相位偏移，直接关联细胞干质量与光学路径差（OPD），成为极具潜力的解决方案。发表于《Scientific Reports》的最新研究《Multiparametric quantification of bacterial cells using digital holographic microscopy》中，由西班牙微纳米技术研究所（IMN-CNM）的Alvaro Cano等学者领衔的团队，建立了一套结合多项式背景校正、高斯滤波与自适应掩模的DHM图像处理流程，实现了对两种典型细菌——球形革兰氏阳性菌表皮葡萄球菌（S. epidermidis）和杆状革兰氏阴性菌大肠杆菌（E. coli）的高通量多参数定量分析。

研究采用的关键技术方法包括：通过电喷雾电离（ESI）将静止期细菌沉积于盖玻片并固定于LB培养基液层中；利用透射式离轴DHM系统（激光波长666 nm，63倍油镜）采集全息图，经傅里叶滤波与菲涅尔衍射数值重建获得相位图像；通过16阶多项式拟合校正背景曲率，4像素半径高斯滤波抑制高频噪声，自适应阈值分割与形态学操作提取细菌区域；基于OPD积分与折射率增量α（1.9×10^?4 m³/kg）计算干质量，并结合区域属性分析形态参数。

背景降噪与图像优化

研究团队首先通过多项式表面拟合消除OPD图像中的背景倾斜与不均匀照明。随着多项式阶数增加，低频噪声逐渐降低，但计算耗时急剧上升。权衡后发现16阶多项式可降低30%噪声且仅需约1秒处理时间，成为最优选择。

随后采用高斯滤波（半径4像素）平滑细胞轮廓，二维离散傅里叶变换（2D-DFT）分析显示该参数能有效保留细菌形状信息的同时抑制高频噪声。

自适应掩模与细菌分割

针对球菌与杆菌的形状差异，研究采用块尺寸127像素的自适应阈值分割，结合形态学开运算（圆盘形结构元素）去除噪点，再通过膨胀操作连接断裂区域。最终从29张表皮葡萄球菌和27张大肠杆菌DHM图像中分别提取179和177个有效细菌区域。

细菌干质量与形态参数表征

干质量计算显示，表皮葡萄球菌平均干质量约180 fg，大肠杆菌约470 fg。通过三维散点图（干质量-圆形度-偏心度）可清晰区分两种细菌种群。进一步利用高斯混合模型（GMM）对表皮葡萄球菌圆形度（C=4π×Area/Perimeter²）分布拟合，识别出单细胞（均值0.998）与簇状细胞（均值0.83）两个亚群，占比相近（51% vs 49%）。过滤簇状细胞后，两种细菌在参数空间中完全分离。

大肠杆菌的偏心度（ε=√[1-(b/a)²]）接近1且与干质量正相关，长度随干质量增加（L(μm)=1.193+0.006×干质量(fg)），而宽度保持恒定，符合杆菌轴向伸长生长的已知规律。

DHM与NMS技术对比

与超高灵敏度NMS技术相比，DHM单细胞干测量的变异系数（CV）约为35%（NMS为2%），主要误差源于OPD背景噪声与分割面积不确定性。但二者种群平均干质量高度一致，且DHM分布经Koch-Schaechter模型拟合后，测得表皮葡萄球菌分裂平均质量272 fg（CV=28%），大肠杆菌751 fg（CV=28%），与NMS结果（243 fg vs 758 fg）吻合。

该研究建立的DHM流程在保持种群水平统计可靠性的前提下，将单细胞分析通量提升至分钟级，且能同步获取形态参数。其液体环境兼容性、无需标记及商业化设备基础，为活菌动态监测、抗生素药敏测试及细菌生理状态研究提供了更易推广的工具。尽管当前样本限于灭活细菌，但技术框架可直接扩展至活体研究，未来通过优化相位稳定性与算法效率，有望在临床诊断、环境微生物学中实现更广泛应用。