Sgk1通过Stat3-Mycl轴调控破骨细胞分化的新机制：靶向Ctsk转录治疗骨质疏松的潜力

《Scientific Reports》：Mycl, activated by Sgk1-phosphorylated Stat3, mediates osteoclastogenesis via Ctsk transcriptional regulation

本研究针对骨质疏松等骨代谢疾病中破骨细胞过度活化的治疗难题，揭示了血清/糖皮质激素调节激酶1（Sgk1）通过磷酸化Stat3（Tyr705）上调转录因子Mycl，直接激活组织蛋白酶K（Ctsk）基因转录的新通路。研究人员通过体内外实验证实，Sgk1抑制剂GSK650394可显著改善小鼠骨微结构及力学性能，且Mycl过表达能逆转Sgk1抑制导致的破骨细胞分化障碍。该发现不仅阐明了Sgk1-Stat3-Mycl-Ctsk轴在骨稳态中的关键作用，更为靶向骨吸收异常提供了新策略。

　　

骨骼并非一成不变的支架，而是一个动态变化的活组织，通过骨重塑过程不断自我更新。这一过程依赖于破骨细胞（osteoclast）的骨吸收和成骨细胞（osteoblast）的骨形成之间的精密平衡。一旦平衡被打破，尤其是破骨细胞过度活化，就会导致骨质疏松、炎性关节炎等骨骼疾病。尽管核因子κB受体活化因子配体（RANKL）及其下游核心转录因子NFATc1（Nuclear factor of activated T cells 1）是调控破骨细胞分化的经典通路，但越来越多的证据表明，代谢压力、激素波动等系统性信号也深度参与其中。然而，这些外部信号如何与核心分化程序相衔接，其分子“节点”仍有许多未知。

血清/糖皮质激素调节激酶1（Sgk1）作为一种响应激素信号的AGC激酶，在破骨细胞调控中扮演的角色复杂且有时矛盾。虽有研究报道Sgk1抑制可通过PI3K-AKT通路抑制破骨细胞分化，但在关节炎等炎症环境下，它又可能通过TRAF3/NF-κB加剧骨侵蚀。这种背景依赖性提示Sgk1可能是整合多信号调控骨代谢的关键分子。值得注意的是，Sgk1与信号转导和转录激活因子3（Stat3）的相互作用在肝细胞、肿瘤微环境及巨噬细胞中驱动多种病理过程，但这一互作是否以及如何调控破骨细胞分化——这一在骨质疏松和关节炎中至关重要的过程——仍属未知。

发表在《Scientific Reports》的这项研究，正是为了填补这一空白。研究人员假设，Sgk1-Stat3信号轴可能通过一个尚未在骨代谢中被重视的MYC家族成员——Mycl，来精细调控破骨细胞的功能。与熟悉的c-MYC不同，Mycl因其独特的MB0/MB2结构域可能具有不同的调控特性，且在白血病T细胞中已被证实受Stat3上调，这暗示了该通路在破骨细胞中存在的可能性。

为了验证这一假说，研究团队综合运用了多种关键技术方法。研究使用了16周龄雄性C57BL/6小鼠进行体内实验，并通过腹腔注射Sgk1抑制剂GSK650394评估其对骨代谢的影响。细胞模型主要采用从小鼠股骨和胫骨分离的原代骨髓源性巨噬细胞（BMMs）以及RAW264.7小鼠巨噬细胞系。关键实验技术包括：微型电子计算机断层扫描（micro-CT）用于分析骨微结构；三点弯曲试验用于评估骨生物力学性能；组织形态计量学（包括TRAP染色）用于定量破骨细胞；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清骨转换标志物（PINP和CTX-I）；RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析；染色质免疫沉淀（ChIP）和荧光素酶报告基因实验用于验证Mycl与Ctsk启动子的直接结合；以及蛋白质印迹（Western blot）、定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）、腺病毒过表达/敲低等分子生物学技术。

GSK治疗改善骨质量并抑制破骨细胞活性

为探究Sgk1在骨代谢中的调控作用，研究人员对小鼠进行为期8周的GSK650394腹腔注射。Micro-CT分析显示，治疗组小鼠的骨微结构显著改善，包括骨小梁体积分数（BV/TV）、骨矿物密度（BMD）、皮质骨厚度（Ct.Th）和皮质骨面积（Ct.Ar）均明显增加。

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和骨组织形态计量学分析进一步证实，GSK治疗显著降低了破骨细胞数量（N.Oc/B.Pm）和破骨细胞表面覆盖度（Oc.S/BS）。血清标志物检测显示骨吸收标志物CTX-I水平下降，而成骨标志物PINP无变化，表明Sgk1抑制特异性地靶向了骨吸收过程。此外，三点弯曲试验证明治疗组股骨的最大载荷、弹性模量和屈服强度均显著提升。这些结果共同表明，抑制Sgk1可在不影响骨形成的前提下，有效抑制破骨细胞活性，改善骨质量。

Sgk1抑制减弱BMMs中的破骨细胞分化和标志物表达

在细胞层面，研究发现在破骨细胞分化条件下，GSK处理能显著下调破骨细胞关键基因（Nfatc1, Ctsk, Acp5, Oc-stamp, Dc-stamp）的mRNA表达以及NFATc1蛋白水平，并减少TRAP阳性多核破骨细胞的形成。

通过腺病毒介导的Sgk1基因敲低（Ad-shSgk1）实验，研究人员进一步验证了Sgk1在破骨细胞分化中的重要作用。敲低Sgk1产生了与药物抑制相似的效果，即在有或无RANKL刺激下，均能下调破骨细胞相关基因和蛋白的表达。这表明Sgk1不仅参与RANKL诱导的破骨细胞分化放大，也维持着基础状态下的破骨细胞活性。

GSK通过Mycl转录抑制和Stat3失活抑制破骨细胞分化

为深入探索机制，研究人员对经GSK处理的BMMs进行了RNA测序分析。转录组学分析发现，GSK处理后共有647个基因表达发生显著变化，其中337个基因下调。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，下调基因显著富集于破骨细胞分化、黏着斑等通路。在众多下调的基因中，Mycl引起了研究人员的注意。

后续实验证实，GSK处理或Sgk1敲低能显著降低Mycl在mRNA和蛋白水平的表达，而Sgk1过表达则上调Mycl。机制上，GSK处理特异性地降低了Stat3在Tyr⁷⁰⁵位点的磷酸化水平，而不影响总Stat3蛋白量。进一步研究发现，这种抑制并非通过Src通路，而是与Jak2蛋白水平的降低有关。这表明Sgk1可能通过调控Jak2稳定性，进而影响Stat3的磷酸化激活。

Mycl促进破骨细胞分化并直接调控Ctsk转录

那么Mycl在破骨细胞中具体发挥什么功能？功能获得性实验表明，在BMMs中过表达Mycl，能上调破骨细胞关键标志物（Nfatc1, Ctsk）的表达，并促进TRAP阳性多核破骨细胞的形成。机制探索发现，染色质免疫沉淀（ChIP）实验证明Mycl能直接结合到Ctsk基因的启动子区域。荧光素酶报告基因实验进一步证实，Mycl过表达可显著增强Ctsk启动子的活性。这些结果明确了Mycl作为转录因子直接激活Ctsk转录的功能。

Mycl过表达逆转GSK介导的RANKL诱导的破骨细胞生成抑制

最关键的功能验证实验显示，在GSK存在的条件下过表达Mycl，可以逆转GSK对破骨细胞关键基因（Nfatc1, Ctsk）转录和NFATc1蛋白表达的抑制，并挽救破骨细胞的分化能力。

这一系列实验成功地将Sgk1、Stat3、Mycl和Ctsk串联起来，揭示了一条全新的信号轴：Sgk1通过维持Jak2蛋白水平，促进Stat3在Tyr⁷⁰⁵位点的磷酸化激活，活化的Stat3进而上调转录因子Mycl的表达，Mycl则直接结合至Ctsk启动子区域，驱动其转录，最终促进破骨细胞分化和骨吸收功能。

综上所述，本研究首次系统地阐明了Sgk1-Stat3-Mycl-Ctsk信号轴在破骨细胞分化和骨稳态中的关键作用。该研究不仅发现Mycl是连接Sgk1-Stat3信号与破骨细胞功能的关键下游效应器，拓展了我们对MYC家族蛋白在骨代谢中功能多样性的认知，更重要的是，揭示了Sgk1抑制剂GSK650394通过抑制该通路，能够在不影响骨形成的前提下有效抑制骨吸收，改善骨质量，为开发治疗骨质疏松等骨丢失疾病的新型靶向疗法提供了坚实的理论依据和极具潜力的候选靶点。然而，Sgk1在不同细胞类型和病理环境中的双重角色提示，未来的临床转化需要精准靶向破骨细胞内的Sgk1信号，以避免潜在的脱靶效应。