结核分枝杆菌蛋白分泌新机制：ESX-4系统与外膜EsxUT-EsxEF超复合体协同调控致病性

《Nature Communications》：Control of Mycobacterium tuberculosis protein secretion by ESX-4 and the outer membrane EsxUT-EsxEF complex

本研究揭示了结核分枝杆菌蛋白分泌的新范式。研究人员发现ESX-4系统及其外膜超复合体EsxUT-EsxEF不仅调控毒素TNT分泌，还作为“主开关”协调所有ESX系统的效应蛋白分泌。该机制同步调控吞噬体膜透化、营养摄取等关键致病环节，为同时靶向多重结核菌毒力因子提供了新策略。

　　

结核病作为全球最致命的传染病之一，其致病元凶结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的生存策略一直是微生物学研究的热点。这种病原体通过复杂的蛋白分泌系统在宿主细胞内立足，其中ESX（Type VII secretion systems）家族的五套分泌系统尤为关键。传统观点认为，每套ESX系统独立运作，分泌特定效应蛋白执行不同功能：ESX-1介导吞噬体逃逸，ESX-3负责铁离子摄取，ESX-5转运PE/PPE蛋白等。然而，这种“各司其职”的模型无法解释病原体在感染过程中如何协调这些系统的时空激活。更令人困惑的是，结核菌的外膜通透性极低，效应蛋白如何跨越这道屏障始终是未解之谜。

发表于《Nature Communications》的这项研究打破了传统认知。研究团队发现，原本被认为功能局限的ESX-4系统，其实通过与其他蛋白组合形成分子“总开关”，主导了全局性分泌调控。这一发现不仅重新绘制了结核菌的致病图谱，更揭示了可同时攻击多重毒力机制的潜在靶点。

研究人员运用多学科技术手段展开探索：通过流式细胞术和荧光显微镜检测蛋白表面可及性；利用脂质体实验和平面脂双层记录分析膜孔形成能力；采用Pull-down实验和共定位分析验证蛋白互作；通过巨噬细胞感染模型评估体内分泌功能；并借助蛋白质印迹和亚细胞分级技术追踪蛋白定位。关键实验均以结核菌mc26206减毒株及其基因敲除株为模型，确保生物安全性。

EsxU是膜相关蛋白且为毒素分泌所必需

研究首次证实ESX-4系统的分泌底物EsxU具有双重身份：它既作为外膜锚定蛋白参与毒素转运复合体的组装，又能作为效应蛋白被分泌至宿主细胞质。通过特异性抗体标记发现，缺失esxUT或eccC4（ESX-4核心ATP酶）的菌株完全丧失表面毒素TNT的检测信号，而回补实验可恢复毒性，说明EsxU-EsxT异源二聚体是毒素外排的必要元件。

EsxU兼具ESX-4系统外膜组分和分泌蛋白的双重功能

有趣的是，EsxU本身也能被ESX-4系统分泌至感染巨噬细胞的胞质中。这种“一身二职”的特性提示其可能通过动态平衡调节分泌系统的组装与功能。

EsxU和EsxEF的表面定位在结核分枝杆菌中相互依赖

研究进一步发现，位于毒素操纵子cpnT中的EsxE-EsxF与EsxU-EsxT形成共生关系：任一蛋白对的缺失都会导致另一方无法定位至外膜。更关键的是，EsxEF的成孔能力（由其色氨酸残基W48/W38介导）是EsxUT膜定位的先决条件，而EsxUT又反过来影响EsxEF的表面暴露。

EsxUT寡聚体不形成跨膜孔但EsxEF成孔功能决定EsxU定位

体外实验表明，纯化的EsxUT复合体虽能结合膜脂但无法形成稳定跨膜通道，而EsxEF则具有强膜扰动活性。点突变实验证实，破坏EsxEF成孔能力会完全阻断EsxU的外膜定位，说明EsxEF孔道是超复合体功能的核心。

EsxEF和EsxUT在E.coli细胞质中形成稳定非经典异源复合体

在无ESX系统干扰的大肠杆菌中共表达四类Esx蛋白，通过亲和纯化发现它们能形成多种化学计量比的超稳定复合体。这些复合体对SDS、DMSO、尿素等变性剂具有异常抗性，提示其结构高度稳定。

EsxEF和EsxUT在结核分枝杆菌外膜形成非经典异源复合体

在结核菌中外膜共定位实验直接观测到EsxEF与EsxUT的共聚集，且这种共定位依赖于四蛋白共存。这表明在天然环境中，二者确实以外膜超复合体形式存在。

EsxEF和EsxUT是其他小Esx效应蛋白表面暴露所必需

突破性发现在于，该超复合体对所有ESX系统的Esx蛋白（如ESX-1的EsxA、ESX-3的EsxH、ESX-5的EsxN等）的表面定位具有全局调控作用。缺失EsxEF或EsxUT使这些蛋白的外膜信号降至背景水平，说明超复合体可能是各ESX系统共用的外膜“通用通道”。

EsxEF和EsxUT是结核分枝杆菌其他小Esx蛋白分泌所必需

分泌实验进一步验证，EsxEF/EsxUT的缺失会显著抑制ESX-1、ESX-3、ESX-5底物的胞外分泌。值得注意的是，EsxUT缺失的影响比EsxEF更显著，提示其在调控层级中居于上游。

EsxEF和EsxUT为ESX-1、ESX-3和ESX-5系统的蛋白输出和分泌所必需

功能实验表明，EsxEF-EsxUT超复合体还调控非Esx蛋白的分泌：ESX-1底物EspB的胞内递送、ESX-3依赖的铁摄取能力以及ESX-5底物PPE62的表面暴露均受其控制。

EsxEF-EsxUT超复合体在巨噬细胞内调控其他ESX系统的效应蛋白分泌

在感染模型中，该超复合体同样协调ESX-1/2/4效应蛋白的分泌。缺失任一组件会显著抑制EsxA、EsxC等的胞质递送，证明该调控机制在生理环境下依然成立。

EsxUT、EsxCD和EsxEF是结核分枝杆菌的分泌效应蛋白且为吞噬体透化所必需

通过伽马干扰素（Galectin-3）标记和PPD抗体通透性实验，研究证实EsxCD、EsxUT、EsxEF与已知的EsxAB一样，都是吞噬体膜透化的关键执行者。回补实验可恢复膜损伤表型，说明这些蛋白直接参与病原体逃逸过程。

讨论与展望

本研究颠覆性地揭示了Esx蛋白的双重功能：既是各ESX系统的外膜结构组分，又是可分泌的效应蛋白。尤其重要的是，ESX-4系统通过EsxEF-EsxUT超复合体架起了不同分泌系统间的通信桥梁。该调控机制很可能由应激信号（如缺氧、营养匮乏）通过σ因子SigM触发——SigM可强力诱导esx-4和cpnT操纵子表达，进而启动级联分泌反应。

从治疗视角看，此发现具有双重意义：一方面，它解释了结核菌如何通过“中枢开关”同步激活多重毒力途径；另一方面，这个单一节点本身的脆弱性为广谱抗结核策略提供了新思路。针对该超复合体的抑制剂或疫苗，有望绕过结核菌外膜的低通透性屏障，实现“一石多鸟”的治疗效果。尽管ESX系统是否为结核菌唯一的分泌途径仍有争议，但本研究无疑为理解其致病网络提供了全新框架，也为对抗这种古老病原体开辟了新的战场。