Bacteroidota蛋白转运与滑行运动共享新机制：二硫键介导的外膜蛋白与移动轨道的共价偶联

《Nature Communications》：A shared mechanism for Bacteroidota protein transport and gliding motility

本研究揭示了Bacteroidota菌门中Type 9分泌系统（T9SS）与滑行运动共享一种前所未有的能量传递机制：外膜蛋白通过二硫键共价连接至移动的胞内轨道结构，从而实现蛋白转运和细胞运动。团队通过冷冻电镜解析了Porphyromonas gingivalis中3 MDa的PorKN环形微轨道结构，并结合生化实验与单分子追踪技术，证实GldK/PorK通过二硫键分别偶联黏附蛋白载体SprF和T9SS组分PorG。该发现不仅革新了滑行运动与T9SS的偶联模型，更为针对Bacteroidota致病菌的抗菌策略提供了新靶点。

　　

在人体肠道和自然环境中广泛存在的Bacteroidota菌门，既是重要的共生菌，也是牙周炎、败血症等疾病的机会性病原体。这类细菌拥有两大“看家本领”：一是通过滑行运动在固体表面快速移动，二是利用Type 9分泌系统（T9SS）将毒力因子等蛋白质转运至细胞表面。长期以来，学者们推测这两种过程共享能量传递链，但二者如何具体偶联仍是不解之谜。更令人困惑的是，非运动的致病菌（如牙周炎主要病原体Porphyromonas gingivalis）同样依赖T9SS，其能量传递机制是否与运动菌株存在进化关联？这一问题亟待解答。

为揭开这一谜题，牛津大学Xiaolong Liu等研究人员聚焦于模式滑行细菌Flavobacterium johnsoniae。该菌的滑行运动依赖于表面黏附蛋白SprB，而SprB通过外膜蛋白SprF锚定于细胞表面。传统模型认为，SprF与由脂蛋白GldJ聚合形成的滑行轨道发生非共价相互作用，但该模型无法解释运动过程中巨大的机械力如何维持稳定性。本研究团队通过AlphaFold3预测发现，SprF与GldJ之间难以形成合理复合物，转而将目光投向SprF胞内段的一对高度保守的半胱氨酸（Cys-Xaa-Cys基序）。

通过基因突变、二硫键交联实验和单分子追踪技术，团队发现：SprF通过Cys326与轨道组分GldK的Cys343形成二硫键，从而将黏附蛋白复合物共价“锁”在移动轨道上。

若破坏该二硫键（如突变SprF或GldK的关键半胱氨酸），虽不影响SprB的分泌，但会导致黏附蛋白失去持续螺旋运动能力，仅能短暂移动或停滞。尤为关键的是，GldK的Cys343在非运动的P. gingivalis的同源蛋白PorK中同样保守，提示该机制可能普适于T9SS功能。进一步实验证实，PorK通过二硫键与T9SS必需组分PorG连接，且该连接对T9SS底物分泌至关重要。

为揭示轨道结构基础，团队利用冷冻电镜解析了P. gingivalis PorKN复合物的近原子分辨率（2.4 ?）结构。该复合物由33个PorK/PorN异二聚体形成直径约54纳米的刚性环状结构，其膜近端平面与外膜相贴，且PorG结合位点（Cys356）位于环内侧。

通过AlphaFold3建模，团队进一步预测了F. johnsoniae滑行轨道的结构：GldJ、GldK、GldN以等摩尔比例形成纤丝状复合物，其中GldK与GldJ反向平行排列，GldN填充其间，而SprF/PorG结合位点位于轨道膜侧面中心。

关键实验方法

研究综合利用了基因编辑（构建F. johnsoniae与P. gingivalis的基因敲除/点突变菌株）、二硫键交联捕获与免疫印迹分析、单分子荧光追踪技术（实时观测SprB运动轨迹）、冷冻电镜（解析PorKN复合物3.2 ?结构）以及AlphaFold3蛋白质结构预测与相互作用建模。

研究结果

1. 1.
   SprF通过二硫键与滑行轨道组分GldK偶联
   突变SprF胞内段双半胱氨酸基序（Cys324/Cys326）或GldK Cys343均会破坏二硫键形成，导致滑行功能丧失。单分子追踪显示，突变体中SprB仅能进行短暂定向移动，证明二硫键是黏附蛋白持续运动的必要条件。
   
2. 2.
   PorG与GldK的二硫键连接驱动T9SS功能
   在F. johnsoniae中，PorG通过其C端半胱氨酸基序与GldK Cys343形成二硫键，该连接对T9SS底物（尤其是Type A底物）分泌不可或缺。P. gingivalis PorG的单一半胱氨酸（Cys232）突变同样 abolished T9SS活性，表明该机制在Bacteroidota中保守。
   
3. 3.
   PorKN环形复合物作为“迷你轨道”的结构特征
   冷冻电镜结构显示PorKN环为刚性整体，无显著构象变化，支持其作为旋转轨道直接牵引偶联蛋白的模型。AlphaFold3预测的滑行轨道模型进一步揭示了GldJKN纤丝的分子排列方式。
   

结论与意义

本研究首次揭示了二硫键介导的机械力传递新机制：Bacteroidota通过共价连接将外膜蛋白锚定于移动轨道，从而协同实现滑行运动与蛋白分泌。该发现革新了现有模型，证明滑行轨道与T9SS能量传递链实为同一结构体系。从进化视角看，T9SS可能起源于滑行机器的一部分，后期在非运动菌中简化为环形PorKN“迷你轨道”。这一机制为理解Bacteroidota的致病性提供了新视角，其特有的二硫键连接位点或成为新型抗菌药物的靶点。论文发表于《Nature Communications》，为微生物运动与分泌系统研究树立了新的里程碑。