在天然无序肽中直接检测NH-π氢键：为蛋白质非经典相互作用提供实验证据

《Nature Communications》：Direct detection of an NH-π hydrogen bond in an intrinsically disordered peptide

本研究针对非经典氢键在蛋白质中实验证据有限的问题，开展了对阿尔茨海默病相关淀粉样β肽（Aβ）E22G突变体中NH-π相互作用的直接检测。研究人员通过多维核磁共振（NMR）波谱、分子动力学（MD）模拟和密度泛函理论（DFT）计算，首次在天然无序蛋白（IDP）中观测到Gly22酰胺质子与Phe20芳香环碳原子之间通过氢键介导的标量耦合（J耦合），为NH-π相互作用在蛋白质表面存在的普遍性提供了直接实验证据，对理解IDP的构象动力学具有重要意义。

　　

在结构生物学的微观世界里，氢键如同维持蛋白质大厦的钢筋水泥，决定着蛋白质的立体结构和功能动态。然而，在众多氢键类型中，有一类特殊的非经典氢键——XH-π相互作用，特别是NH-π氢键，长期以来如同“暗物质”般存在：理论预测其广泛存在，但实验证据却寥寥无几。这类涉及π电子的氢键被认为在蛋白质的折叠、稳定和功能发挥中扮演着重要角色，尤其是在天然无序蛋白（IDP）中，它们可能为理解这些缺乏固定结构的蛋白质如何行使功能提供关键线索。

传统上，科学家们主要关注的是常规氢键，即由电负性原子（如O、N）作为供体和受体的相互作用。而非经典的XH-π氢键，其中芳香环的π电子云作为氢键受体，其研究面临着巨大挑战。在折叠蛋白质的紧密疏水核心中，虽然结构生物信息学分析预测约有10%的芳香环可能参与XH-π相互作用，但直接的实验验证却极为有限，此前仅有少数关于CH-π相互作用的报道。而在溶剂暴露的蛋白质表面，特别是天然无序蛋白中，由于存在多种竞争性相互作用模式，NH-π相互作用的存在和功能角色更是迷雾重重。

德国杜塞尔多夫大学、马克斯·普朗克多学科科学研究所等机构的研究团队将目光投向了与阿尔茨海默病相关的淀粉样β肽（Aβ）。他们巧妙地利用E22G突变体（Arctic变异），在这个天然无序肽中寻找NH-π相互作用的直接证据。研究聚焦于Gly22的酰胺质子与其前第二个残基Phe20的芳香环之间可能存在的特殊相互作用。通过多种先进的生物物理技术，研究人员不仅提供了NH-π氢键存在的间接证据，更首次直接检测到了通过氢键介导的微小标量耦合，这一突破性发现发表在《Nature Communications》上，为理解蛋白质中非共价相互作用的多样性打开了新窗口。

关键技术方法包括：多维核磁共振（NMR）波谱分析（化学位移、温度系数、异核耦合）、分子动力学（MD）模拟、密度泛函理论（DFT）计算、非共价相互作用（NCI）分析、拉曼光谱以及生物信息学序列分析。研究使用了重组表达的氟标记Aβ40肽和化学合成的位点特异性氟标记肽。

Gly22异常的上游化学位移

酰胺质子（H^N）和氮原子化学位移是蛋白质骨架NH基团局部电子环境的敏感探针。研究人员发现，在E22G-Aβ40中，突变残基Gly22的相关峰显示出异常的上游化学位移——H^N位移约0.9 ppm，N位移约-2 ppm，这种变化提示Gly22的NH基团可能位于芳香环中心上方，受到芳香环电流效应的影响。

Gly22化学位移的近零温度系数

温度系数能够反映酰胺质子是否参与稳定的相互作用。在E22G-Aβ40中，Gly22显示出接近零的温度系数，而野生型中的Glu22则具有较大的负值。这种H^N上游化学位移与近零温度系数的组合，强烈表明Gly22的NH与附近芳香环π电子云之间存在持久相互作用。

Phe20环参与与Gly22的相互作用

利用¹⁹F化学位移对其化学环境的卓越敏感性，研究人员制备了在三个苯丙氨酸（Phe4、Phe19和Phe20）和一个酪氨酸（Tyr10）残基上标记氟原子的重组肽。只有属于Phe20环的¹⁹F峰被E22G突变显著位移，表明该残基在突变时经历了特定的环境变化。此外，氟取代芳香环的磁屏蔽效应减弱也支持了Gly22和Phe20环的空间邻近性。

突变短肽中Phe环振动的改变

拉曼光谱显示，在截短的三肽或四肽中，E22G突变导致苯丙氨酸芳香环的对称环伸缩振动模式v₁₂和面内环伸缩振动模式v_8a发生微小但一致的红移，这与芳香环参与相互作用的建立相一致。

通过MD和DFT表征NH-π相互作用

分子动力学模拟使用a99SB-disp力场进行了3μs的模拟，结果显示在E22G肽中，Gly22和Phe20之间存在显著且持久的NH-π相互作用。从MD轨迹中提取的帧满足NH-π相互作用的所有几何标准（距离d_CN和角度θ）。密度泛函理论计算和非共价相互作用分析揭示了Gly22的NH和Phe20的芳香环之间存在弱相互作用特征。

通过J耦合直接检测NH-π相互作用

最令人信服的证据来自通过氢键介导的标量耦合的直接检测。DFT计算预测Gly22的酰胺质子与Phe20的芳香碳原子之间存在约0.10-0.26 Hz的J耦合值。研究人员设计了特殊的长时间转移延迟（0.25秒）的¹H,¹³C SOFAST-HMQC（异核多量子相干）实验，成功观测到了Gly22的酰胺质子与Phe20芳香环的Cγ、Cδ和Cε之间的相关峰，信噪比约为5-7。这些通过J耦合介导的相关性为NH-π相互作用的存在提供了最直接的证据。

FAG及类似序列基序在IDP中的普遍性

生物信息学分析显示，在7663个独特的IDP/IDR中，约7%含有特定的Aro-x-Gly或Gly-x-Aro基序（Aro：Phe、Tyr、Trp），表明NH-π氢键在IDP中可能普遍存在。

这项研究首次提供了天然无序肽中NH-π氢键存在的直接实验证据，突破了以往仅靠理论预测和间接推论的局限。通过直接检测通过氢键介导的标量耦合，研究人员为理解蛋白质中非经典氢键的物理化学性质提供了坚实依据。特别值得注意的是，这一相互作用发现于溶剂暴露的蛋白质表面，而非传统的疏水核心，这表明即使在存在竞争性水分子相互作用的条件下，NH-π氢键仍能稳定存在。

该研究的意义不仅在于证实了一个特定的分子相互作用，更重要的是它建立了一个研究框架，为在更广泛的蛋白质体系中探索非经典氢键提供了方法论基础。鉴于甘氨酸和芳香族残基在相分离IDP中的相对丰富性，这类NH-π相互作用可能在调控生物分子凝聚体的热力学和动力学方面发挥重要作用。此外，与阿尔茨海默病相关的E22G突变体中的这一特定相互作用，为理解Aβ肽的错误折叠和纤维化过程提供了新的视角，可能解释该突变如何通过引入动力学屏障而影响纤维形成的路径。

虽然这项研究聚焦于一个特定的天然无序肽体系，但其研究策略和发现具有广泛的启示意义。未来在具有单一明确结构的蛋白质中结合实验和计算研究NH-π相互作用，将为了解这些相互作用的本质提供更多关键见解。随着技术的进步和方法的完善，我们有望揭开更多蛋白质“暗相互作用”的面纱，深入理解这些微弱但可能至关重要的分子力量如何在生命活动中发挥调节作用。