SLC45A4作为过氧化物酶体腐胺转运体调控GABA从头合成的新机制

《Nature Communications》：SLC45A4 encodes a peroxisomal putrescine transporter that promotes GABA de novo synthesis

本研究针对SLC45A4这一孤儿转运体的功能未知问题，通过代谢组-转录组关联分析发现其与γ-氨基丁酸(GABA)水平显著相关。研究人员采用稳定同位素示踪等技术，证实SLC45A4是定位于过氧化物酶体的腐胺(putrescine)转运体，通过精氨酸/鸟氨酸/腐胺(AOP)通路促进GABA合成。该发现不仅揭示了GABA代谢调控新机制，也为相关疾病治疗提供了潜在靶点。

　　

在细胞代谢的复杂网络中，溶质载体(SLC)转运蛋白家族扮演着至关重要的角色，它们如同细胞的"门户"，负责调控各种离子和代谢物跨膜运输。人类基因组中已有450多个SLC基因被注释，但令人惊讶的是，约30%的成员仍属于"孤儿转运体"——它们的生化功能和底物特性至今成谜。这种认知缺口严重制约了我们对细胞代谢调控网络的理解，也阻碍了相关疾病治疗策略的开发。

SLC45A4正是这样一个充满谜团的转运蛋白。早期研究基于其与拟南芥蔗糖转运体的同源性，推测它可能是一种质子(H⁺)关联的蔗糖转运体。然而，这种推测与它在癌症中的复杂表现形成了鲜明对比：在骨肉瘤中SLC45A4表达与肿瘤抑制正相关，而在胰腺导管腺癌中却与更高风险相关。这种矛盾现象暗示SLC45A4可能具有比蔗糖转运更为复杂的生物学功能，亟待深入探索。

γ-氨基丁酸(GABA)作为重要的神经递质，其代谢调控机制在神经系统中已被广泛研究，但在外周组织中的合成途径却知之甚少。除了经典的谷氨酸脱羧酶(GAD)通路，精氨酸-鸟氨酸-腐胺(AOP)通路也是GABA合成的重要途径，特别是在缺乏GAD的非神经组织中。这种代谢通路的多样性提示我们，GABA的调控网络可能比现有认知更为复杂。

为了解决这些科学问题，罗格斯大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了创新性研究成果。他们开发了代谢组-转录组关联分析方法，意外发现SLC45A4的表达与细胞内GABA水平呈现极强的正相关性，这一关联甚至强于已知的GABA转运体(GAT1/SLC6A1、GAT2/SLC6A13、GAT3/SLC6A11)和GABA合成酶(GAD1、GAD2)。这一发现促使研究人员重新思考SLC45A4的生物学功能。

研究团队主要采用了多组学整合分析、稳定同位素示踪、基因编辑和细胞生物学等关键技术方法。其中代谢组-转录组关联分析基于癌症细胞系百科全书(CCLE)中898个人类癌细胞系的数据，稳定同位素示踪使用了¹³C、²H等标记的代谢物，基因操作包括siRNA敲低、CRISPR/Cas9基因敲除和过表达技术，亚细胞定位研究则通过免疫荧光和过氧化物酶体分离技术实现。

转录组-代谢组关联分析揭示SLC45A4在GABA代谢中的作用

通过系统分析898个癌细胞系的基因表达和代谢物数据，研究人员建立了线性回归模型来评估基因与代谢物之间的关联。结果显示，已知的转运体如SLC6A8(肌酸转运体)、SLC22A5(肉碱转运体)和SLC6A6(牛磺酸转运体)都与其相应底物的细胞水平高度相关，验证了分析方法的可靠性。引人注目的是，SLC45A4与GABA水平的相关性在所有基因中最为显著，这为后续功能研究提供了重要线索。

实验验证表明，在SLC45A4高表达的A549和H1299细胞中，GABA水平显著高于低表达的HepG2细胞。更重要的是，在HepG2细胞中过表达SLC45A4能够直接提高GABA水平，而通过siRNA敲低SLC45A4则显著降低GABA含量，证实了SLC45A4对GABA水平的调控作用。

SLC45A4通过促进GABA从头合成提高细胞GABA水平

研究人员首先排除了SLC45A4作为蔗糖转运体的可能性。在¹³C₆-葡萄糖培养实验中，添加蔗糖并未影响糖酵解和三羧酸循环中间产物的¹³C标记模式，表明这些细胞在基础SLC45A4表达情况下并不代谢蔗糖。

接着，通过¹³C_{4-GABA摄取实验发现，虽然SLC45A4敲低降低了总GABA水平，但这种降低主要源于内源性未标记GABA(¹²C4-GABA)的减少，而非标记GABA摄取的下降。非靶向代谢组学分析进一步证实，变化最显著的代谢物特征都与未标记GABA相关。这些结果一致表明SLC45A4并不直接转运GABA，而是参与GABA的从头合成调控。}

鸟氨酸是人类癌细胞中GABA从头合成的主要来源

为了探究GABA合成途径，研究人员比较了GAD通路和AOP通路的贡献。稳定同位素示踪实验显示，虽然¹³C_{5-谷氨酰胺能够有效标记谷氨酸(50-70%)，但产生的标记GABA极少。相反，¹³C6-精氨酸能够标记超过30%的GABA，表明AOP通路是这些细胞中GABA合成的主要途径。}

有趣的是，研究人员发现胎牛血清(FBS)中的精氨酸酶活性能够将培养基中的精氨酸转化为鸟氨酸。通过热灭活血清消除这种活性后，双标记实验(¹³C₆-精氨酸和²H₆-鸟氨酸)显示98%的标记GABA来自鸟氨酸，仅有不到2%来自精氨酸，证实鸟氨酸是GABA合成的主要前体。

SLC45A4促进从鸟氨酸和腐胺的GABA从头合成

通过在HepG2细胞中过表达SLC45A4，研究人员观察到从²H₆-鸟氨酸生成的GABA显著增加。为了验证SLC45A4的必要性，他们在A549和H1299细胞中构建了SLC45A4敲除(KO)系。结果显示，敲除SLC45A4显著降低了从鸟氨酸生成GABA的能力，但并未完全消除。

更令人困惑的是，双标记实验(²H₆-鸟氨酸和¹³C₄-腐胺)显示，SLC45A4敲除显著降低了来自鸟氨酸的²H₆-GABA，却不影响来自外源腐胺的¹³C₄-GABA。同时，敲除细胞中积累了²H₆-腐胺，提示腐胺氧化过程受阻。

GABA合成依赖于鸟氨酸脱羧酶和二胺氧化酶的活性

为了阐明这种差异的机制，研究人员探索了腐胺氧化的酶学基础。使用二氟甲基鸟氨酸(DFMO)抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC1)后，细胞内腐胺和GABA水平均下降，而过表达ODC1则提高两者水平。值得注意的是，ODC1过表达并不能完全挽救SLC45A4敲除细胞的GABA合成缺陷。

酶抑制剂实验表明，二胺氧化酶(DAO)抑制剂(戊脒和氨基胍)显著抑制GABA生成，而单胺氧化酶(MAO)抑制剂影响较小，提示DAO是腐胺氧化的主要酶类。进一步实验发现，血清中的DAO活性可能负责细胞外腐胺的氧化，而细胞内腐胺的氧化则依赖于SLC45A4。

SLC45A4编码过氧化物酶体腐胺转运体

亚细胞定位研究解决了这一矛盾。免疫荧光显示SLC45A4定位于过氧化物酶体膜，与过氧化物酶体标志蛋白ABCD3共定位，而不与质膜、高尔基体、内质网或线粒体标志物共定位。

通过免疫沉淀和密度梯度离心分离过氧化物酶体，进一步证实SLC45A4与过氧化物酶体蛋白ABCD3和过氧化氢酶共同富集。功能实验显示，包含SLC45A4的蛋白脂质体能够特异性摄取³H-腐胺，证实其腐胺转运活性。

本研究通过创新的多组学关联分析策略，成功"去孤儿化"了SLC45A4的功能，揭示其作为过氧化物酶体腐胺转运体在GABA代谢中的关键作用。这一发现不仅拓展了我们对GABA合成调控网络的认识，也凸显了亚细胞区室化在代谢调控中的重要性。SLC45A4通过介导腐胺进入过氧化物酶体，使其能够被DAO氧化生成GABA，这种区室化的代谢通路可能代表了一种普遍存在的代谢调控机制。

该研究的另一重要意义在于展示了CCLE数据库在基础生物化学研究中的价值。通过系统关联基因表达与代谢物水平，能够发现新的代谢调控关系，为理解细胞代谢网络提供新视角。同时，研究结果也提示我们，转运体的功能不能仅基于其与代谢物浓度的相关性来判断，需要结合其亚细胞定位和代谢背景进行综合分析。

值得注意的是，SLC45A4的生理功能可能超出其编码的转运蛋白本身。该基因座通过可变剪接产生的环状RNA(circSLC45A4)在人类胎儿皮层中高表达，并参与维持神经前体细胞状态。这种多层面的功能复杂性提示我们需要更全面地理解基因功能的不同维度。

总之，这项研究为理解GABA代谢调控提供了新视角，也为孤儿转运体的功能研究提供了可借鉴的方法学框架。未来对SLC45A4在polyamine代谢中作用的深入研究，可能为相关疾病治疗开辟新的途径。